Д. Иу. Риазантсев, Е. М. Цхудинова, Л. Иу. Кокаева, С. Н. Елански, П. Н. Балабко, Г. Л. Белова, С. К. Завриев
Фитопатогена гљива Цоллетотрицхум цоццодес узрокује опасне болести код кромпира и парадајза познатих као антракноза и црна пегавост гомоља. По морфолошким карактеристикама, често их је тешко разликовати од болести изазваних другим микроорганизмима; на плодовима зеленог парадајза болест може бити асимптоматска, манифестујући се само на зрелим црвеним плодовима. За брзу и тачну дијагнозу патогена нуди се ПЦР систем за тестирање у реалном времену. Да би се развио тест систем, одређена је нуклеотидна секвенца гена глицерол трифосфат дехидрогеназе од 45 Ц. сојева цоццодес изолованих из кртола кромпира у различитим регионима Русије.
На основу добијених резултата и анализе сличних секвенци других врста доступних у бази података ГенБанк, дизајнирани су прајмери специфични за врсте и сонда за Ц. цоццодес. Да би се испитала специфичност креираног тест система, ПЦР је обављен са ДНК изолованом из чистих култура 15 различитих врста паразитских и сапротрофних гљива повезаних са биљкама парадајза и кромпира (Фусариум окиспорум, Ф. вертициллиум, Пхомопсис пхасеоли, Алтернариа алтерната, Хелминтхоспориум солани, Цоллетотрицхум цоццодес Пхеллинус ферругинеовелутинус, Стемпхилиум весицариум, Хелминтхоспориум солани, Пхомопсис пхасеоли, Неонецтриа радицицола, Рхизоцтониа солани, Пенициллиум сп., Цладоспориум фулвум, Ц. цладоспориоидес). Присуство ДНК Цоллетотрицхум цоццодес утврђено је на граничном циклусу од 20–27, док су друге врсте откривене након 40 циклуса или нису откривене. Тест систем омогућава поуздану детекцију концентрације ДНК Ц. цоццодес веће од 0.01 нг / мм3 у анализираној ПЦР смеши. Коришћењем развијеног система за испитивање испитивано је присуство Ц. цоццодес у листовима парадајза са симптомима гљивичних болести и у кртолама кромпира без спољних симптома болести. Листови са симптомима гљивичне инфекције сакупљани су са два различита поља у Краснодарској области, кртоле - са поља у Костромској, Московској, Калушкој, Нижњеновгородској области. Један лист парадајза који садржи ДНК Ц. цоццодес пронађен је у Краснодарској територији; значајно присуство ДНК овог патогена откривено је у 5 узорака кртола узгајаних у регионима Кострома, Москва, Калуга.
Увод
Гљиве из рода Цоллетотрицхум су опасни фитопатогени који погађају житарице, поврће, биље, вишегодишње воће и јагодичасто биље. Једна од свеприсутних врста овог рода, Цоллетотрицхум цоццодес (Валлр).
Хугхес, узрочник је антракнозе и црне мрље кромпира и парадајза, узрокујући болести бројних других биљака породице Соланацеае, укљ. коров (Диллард, 1992). Ц. цоццодес инфицира све подземне делове биљке, базе стабљика, лишће и плодове (Андривон и сар., 1998; Јохнсон, 1994). На кори заражених кртола кромпира примећује се развој сивих мрља са нејасно израженим ивицама на којима су јасно видљиве црне тачке спорулације и микросклеротије. Током складиштења, у пулпи кртола могу настати чиреви са омекшаним садржајем, тј. болест улази у фазу антракозе, која је, међутим, изузетно ретка.
Истовремено, симптоми антракозе (чир на кожи са малим црним тачкама) типични су за плодове парадајза. На лишћу се симптоми Ц. цоццодес појављују као тамно смеђе мрље, обично обрубљене жутим ткивом (Јохнсон, 1994).
Развој црне пегавости на кртолама квари њихов изглед, што је посебно изражено када се продаје опрани црвенокожи кромпир. Пилинг пилинга доводи до прекомерног испаравања и повећаних губитака у складишту (Хунгер, МцИнтире, 1979). Оштећење других биљних органа доводи до губитака приноса, што је забележено и на отвореном и на затвореном терену (Јохнсон, 1994; Тсрор и сар., 1999). Болести изазване Ц. цоццодес честе су у готово свим регионима света који производе кромпир, укључујући и Русију (Лееса, Хилтон, 2003; Белов ет ал, 2018). Сузбијање ових болести је тешко због недовољне ефикасности постојећих фунгицида против Ц. цоццодес и недостатка отпорних сорти (Реад, Хиде, 1995).
Инокулум Ц. цоццодес може да опстане у семенским кртолама (Реад, Хиде, 1988; Јохнсон и сар., 1997), семенима парадајза (Бен-Даниел и сар., 2010), дуго могу преживети у земљи, на биљним остацима (Диллард, 1990 ; Диллард, Цобб, 1993) и у корову (Раид, Пеннипацкер, 1987). Радови низа аутора (Реад, Хиде, 1988; Баркдолл, Давис, 1992; Јохнсон ет ал., 1997; Диллард, Цобб, 1993) показали су да развој болести код кромпира и парадајза у великој мери зависи од присуства инокулума у семену и тла. Због тога је потребно минимизирати губитке од болести, дијагностиковати (укључујући квантитативне) размножавање гљива у семенском материјалу, у земљи, у кртолама семенског кромпира и семенима парадајза положених на складиштење. Морфолошка дијагностика у земљишту и биљном материјалу може се извршити само присуством микросклеротија, који се, међутим, могу наћи и код других врста гљива.
Симптоми на кртолама су врло слични сребрнастој красти коју изазива гљива Хелминтхоспориум солани. Изолација Цоллетотрицхум цоццодес и Хелминтхоспориум солани у чисту културу прилично је тешка и траје дуго због спорог раста на хранљивом медијуму. Да бисте брзо идентификовали Цоллетотрицхум цоццодес, неопходно је користити инструменталне дијагностичке методе. Најприкладнија метода је ланчана реакција полимеразе (ПЦР) и њена модификација - ПЦР у реалном времену. Тренутно се тест систем који су развили британски истраживачи (Цуллен ет ал., 2002) за ИТС1 регију рДНА користи у Европи и Сједињеним Државама. Његова употреба показала је добре резултате у анализи руских изолата (Белов ет ал, 2018). Међутим, Ц. цоццодес је веома променљив и његово откривање из једне секвенце ДНК може довести до лажно негативних резултата. За поузданију дијагнозу потребна је анализа неколико секвенци ДНК специфичних за неку врсту, у вези с чим смо развили оригинални систем испитивања који омогућава идентификовање Ц. кокода по секвенци гена глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназе.
материјали и методе
За процену ефикасности и специфичности створених тест система користили смо чисте културе 15 врста гљива које су аутори изоловали из оболелих узорака лишћа и плодова парадајза, кртола кромпира (Табела 1). За изолацију узети су органи биљака са симптомима гљивичне инфекције, не више од једног органа по грму.
Кришка кртоле са кором, кришка плода парадајза и оболели лист стављени су под бинокуларни микроскоп, након чега су мицелиј, споре или комад ткива премештени у агарски медијум (агар за сладовине) у Петријеву посуду са наоштреном иглом за сецирање. Изолати су ускладиштени на косим агарима у епруветама на 4 ° Ц.
Узорци листова парадајза са симптомима гљивичних болести, намењени анализи, непосредно након сакупљања (на терену) смештени су у 70% етил алкохол у којем су чувани до изолације ДНК. Гомољи кромпира су испоручени у лабораторију, ољуштени (комад 2 × 1 цм) од њих и замрзнути на –20 ° С. Чувано замрзнуто до изолације ДНК.
Чисте културе гљива за изолацију ДНК узгајане су у течном медију грашка. Мицелијум гљивице је уклоњен из течног медија, осушен на филтер папиру, смрзнут у течном азоту, хомогенизован, инкубиран у ЦТАБ пуферу, пречишћен хлороформом, таложен смешом изопропанола и 0.5 М калијум ацетата и два пута испран са 2% алкохола. Добијена ДНК је растворена у дејонизованој води и чувана на –70 ° С (Кутузова ет ал., 20). Концентрација ДНК измерена је помоћу ХС квантификационог комплета за дволанчану ДНК на Кубит 2017 (Киаген, Немачка). Алкохолизовани и смрзнути узорци су тритурисани у течном азоту, праћено изолацијом ДНК како је горе описано (за мицелиј чистих гљивичних култура).
Табела 1. Порекло употребљених сојева гљива
Име печурке | Биљка, орган | Место избора |
---|---|---|
Цоллетотрицхум цоццодес 1, Ц. цоццодес 2, Ц. цоццодес 3, Илионецтриа црасса, Рхизоцтониа солани | гомољ кромпира | Регија Кострома, кртоле кромпира 1. пољске генерације, сорта Ред Сцарлетт |
Цоллетотрицхум цоццодес 4 | лист кромпира | Реп. Мари Ел, Јошкар-Ола |
Хелминтхоспориум солани | гомољ кромпира | Регион Магадан, поз. Шатор, гомољ кромпира |
Цладоспориум фулвум | лист парадајза | Московска област, парадајз крупних плодова |
Алтернариа томатопхила | парадајз воће | предало особље лабораторије за микологију и фитопатологију Сверуског истраживачког института за заштиту биља |
Фусариум вертициллиум, Пхомопсиспхасеоли, Алтернариа алтерната, Пхеллинус ферругинеовелутинус, Стемпхилиум весицариум, Цладоспориум цладоспориоидес, Ацродонтиум лузулае, Пенициллиум сп. | парадајз воће | Краснодарска територија, Кримски округ, крем крема |
Фусариум окиспорум | корен пшенице | Московска област |
ПЦР је изведен на ДТприме појачивачу (ДНА-Тецхнологи). За ПЦР су коришћени оригинални прајмери и сонда за специфични за регион региона глицерол трифосфат дехидрогеназне гена: прајмер Цоц70гдф –ТЦАТГАТАТЦАТТТЦТЦТЦАЦГГЦА, реверзни прајмер Цоц280гдр - ТАЦТТГАГЦАТГТАГГЦЦТГГГТ1. Прајмери појачавају регион од 213 бп.
Реакција је узела 50 нг укупне ДНК (у анализи лишћа и кртола) и 10 нг (у анализи ДНК чистих култура гљива). Реакциона смеша (35 μл) одвојена је парафинским слојем на два дела: доњи (20 μл) је садржао 2 μл 10 × реакционог пуфера (750 мМ Трис-ХЦл, пХ 8.8; 200 мМ (НХ4) 2СО4; 25 мМ МгЦл2; 0.1% Твеен- 20), 0.5 мМ сваког деоксинуклеотид трифосфата, 7 пмол сваког прајмера и 4 пмол флуоресцентне сонде која се хидролизује; горња је садржала 1 μл 10 × ПЦР пуфера и 1 У Так полимеразе.
Одвајањем смеше са парафином омогућава се епрувете да се дуго чувају на температури од 5 ° Ц и обезбеди врући почетак ПЦР-а након загревања током 10 минута на температури изнад 80 ° Ц. ПЦР је изведен према следећем програму: 94.0 ° Ц - 90 с (1 циклус); 94.0 ° Ц - 30 с; 64.0 ° Ц - 15 с (5 циклуса); 94.0 ° Ц - 10 с; 64.0 ° Ц - 15 с (45 циклуса); 10.0 ° Ц - складиштење.
Резултати и дискусија
Секвенце гена глицерол трифосфат дехидрогеназе одређене су у 45 сојева изолованих од лишћа, стабљика, кртола кромпира и плодова парадајза (Кутузова, 2018) у различитим регионима Русије. Проучене секвенце свих сојева подељене су у 2 групе које се разликују у два нуклеотида. Нуклеотидне секвенце представника обе групе под бројевима КИ496634 и КИ496635 депоноване су у ГенБанк.
Прајмери цоц70гдф, цоц280гдр и сонда цоцгдз дизајнирани на њиховој основи проверени су помоћу програма БЛАСТ (ввв.нцби.нлм.них.гов/бласт) на свим секвенцама гена глицерол трифосфат дехидрогеназе врста из рода Цоллетотрицхум и других организама доступних у бази података ГенБанк.
Нису пронађене ДНК регије других организама који би били веома хомологни прајмерима и сонди.
Осетљивост тест система проверена је помоћу узорака са различитим концентрацијама ДНК Ц. цоццодес, ДНК листа кромпира зараженог антракозом (сакупљеног 2017. у Мари Ел, сорта Ред Сцарлетт) и коре кртола погођених црном пегавошћу (сакупљених у региону Кострома, сорта Ред Сцарлетт, табела 2). Да би се потврдило присуство ДНК у кртолама и лишћу кромпира, из њих су изоловани сојеви Ц. цоццодес у чисте културе.
Резултати анализе осетљивости тест система показују да се он може користити за успешно дијагностиковање присуства ДНК Ц. цоццодес у узорку када је његов укупни садржај у ПЦР смеши већи од 0.05 нг. Ово је сасвим довољно за откривање, јер једна склероција садржи у просеку 0.131 нг, а једна спора око 0.04 нг ДНК (Цуллен ет ал., 2002). Тест систем који је развила британска група (Цуллен ет ал., 2002) показао је сличну осетљивост (праг циклуса 34 на 0.05 нг ДНК и 37 на 0.005 нг).
Анализа природних узорака који садрже Ц. цоццодес у свим случајевима омогућила је поуздано откривање његовог присуства у узорку (табела 2). Предложени метод за изолацију ДНК био је применљив и на анализу природних биљних узорака.
Табела 2. Одређивање осетљивости предложеног тест система за идентификацију Цоллетотрицхум кокода за ПЦР у реалном времену
Образец | Количина ДНК у узорку *, нг | Гранични циклус | Ц. откривање кокодова |
---|---|---|---|
Мицелиум Цоллетотрицхум цоццодес | 50 | 21.3 | + |
5 | 25.7 | + | |
0.5 | 29,7 | + | |
0.05 | 33.5 | + | |
0.005 | 40 | - | |
0.0005 | 42.8 | - | |
0.00005 | - | ||
Кора од гомоља 1 | 50 | 32 | + |
Кора од гомоља 2 | 50 | 30 | + |
Кора од гомоља 3 | 50 | 31.5 | + |
Лист кромпира | 50 | 29.5 | + |
Белешка. * У мешавини ПЦР производа.
Специфичност тест система тестирана је на узорцима ДНК извађеним из 15 врста гљива. Аутори су изоловали све сојеве гљива из погођених и здравих плодова и лишћа парадајза, кртола кромпира; један сој је изолован из корена пшенице (табела 1). Међу врстама изолованим са површине плода постоје и врсте које нису патогене за парадајз (на пример, Пхеллинус ферругинеовелутинус).
Студије су показале да је ДНК Ц. цоццодес откривена у граничном циклусу од 20–27, док друге гљивичне врсте нису откривене или су дале сигнал после 40. циклуса, што се може приписати неспецифичном ефекту буке (табела 3).
Табела 3. Провера система за испитивање различитих врста печурки
Име печурке | Гранични циклус |
Цоллетотрицхум цоццодес 1 | 20.9 |
Ц. кокодови 2 | 22.6 |
Ц. кокодови 3 | 23 |
Ц. кокодови 4 | 22 |
Фусариум окиспорум | > КСНУМКС |
Ф. вертициллиум | > КСНУМКС |
Рхизоцтониа солани | > КСНУМКС |
Пхомопсис пхасеоли | > КСНУМКС |
Алтернариа алтерната | > КСНУМКС |
А. томатопхила | > КСНУМКС |
Хелминтхоспориум солани | > КСНУМКС |
Пхеллинус ферругинеовелутинус | > КСНУМКС |
Стемпхилиум весицариум | > КСНУМКС |
Илионецтриа црасса | > КСНУМКС |
Цладоспориум цладоспориоидес | > КСНУМКС |
Ц. фулвум | > КСНУМКС |
Ацродонтиум лузулае | > КСНУМКС |
, Пенициллиум Сп. | > КСНУМКС |
Белешка. * Количина ДНК у свим узорцима била је 10 нг.
Развијени систем за испитивање коришћен је за идентификацију Ц. цоццодес у узорцима листа парадајза са симптомима некротрофних патогена и кртолама семенског кромпира без видљивих симптома. За студију смо узели семенске кртоле различитих сорти узгајаних у регијама Кострома, Москва, Калуга, Нижњи Новгород. Присуство ДНК Ц. цоццодес сматрано је значајним у узорцима, у чијој анализи гранични циклус није прелазио 35. Ова гранична вредност изабрана је на основу поузданог одређивања 0.05 нг ДНК Ц. цоццодес (гранични циклус 33.5, табела 2) и чињенице да гранични циклуси изнад 40, дијагностикована је неспецифична ДНК неких других врста гљива. Овим приступом откривено је значајно присуство ДНК Ц. цоццодес у 5 узорака кртола узгајаних у регионима Кострома, Москва, Калуга и у једном листу парадајза из округа Иеиск у Краснодарској области (табеле 4, 5).
Табела 4. Откривање кокота Цоллетотрицхум на кртолама кромпира *
Број узорка | Сорта кромпира | Место раста | Ц. откривање кокодова | Гранични циклус |
---|---|---|---|---|
1 | Ред Сцарлет | Регион Кострома | + | 35 |
2 | + | 35 | ||
3 | - | 38 | ||
4 | Санте | Московска област | + | 34 |
5 | - | |||
6 | - | 41 | ||
7 | - | 41.8 | ||
8 | + | 30 | ||
9 | Зхуковски рано | Московска област | - | 40.5 |
10 | - | 40.6 | ||
11 | - | |||
12 | Молли | Регија Калуга | + | 34.3 |
13 | - | 38.4 | ||
14 | Фантазија | Регија Калуга | - | |
15 | Гала | Нижниј Новгород регија. | - | |
16 | - |
Белешка. * Количина ДНК у свим узорцима била је 50 нг.
Табела 5. Откривање Цоллетотрицхум цоццодес на листовима парадајза *
Број узорка | Место раста | Ц. откривање кокодова | Гранични циклус |
---|---|---|---|
1 | Краснодарска територија, Кримски округ | - | |
2 | - | ||
3 | - | ||
4 | - | 45 | |
5 | - | ||
6 | - | ||
7 | - | ||
8 | - | ||
9 | Краснодарска област, округ Јеиск | - | 39.2 |
10 | - | 40.8 | |
11 | - | ||
12 | - | 41.6 | |
13 | - | 40 | |
14 | - | 41 | |
15 | - | 41.9 | |
16 | - | ||
17 | - | ||
18 | - | 40.3 | |
19 | - | ||
20 | - | ||
21 | + | 34.5 | |
22 | - | ||
23 | - |
* Количина ДНК у свим узорцима била је 50 нг.
Тест систем који смо креирали није инфериоран оном који су развили британски истраживачи (Цуллен ет ал., 2002) у осетљивости и специфичности и погодан је за анализу биљних узорака. Његова примена за анализу семенских кртола омогућила је идентификацију ДНК Ц. цоццодес у кртолама без спољних знакова оштећења и успешну анализу заразе лишћа.
До данас у Русији није извршена анализа кртола кромпира на заразу Ц. цоццодес. Наша прва студија показала је да од 16 тестираних семенских кртола узгајаних у различитим регионима Руске Федерације, 5 садржи Ц. цоццодес. То показује да је црна мрља на кртолама кромпира честа болест кромпира у Русији, а његова улога у смањењу обима и квалитета усева кромпира је потцењена.
Анализа лишћа парадајза открила је значајно присуство ДНК Ц. цоццодес у једном листу из округа Иеиск Краснодарске територије. Раније, приликом испитивања поља парадајза на југу Русије помоћу британског тест система (Цуллен ет ал., 2002), пронађени су листови који садрже Ц. цоццодес, а на неким пољима је пронађен висок удео лишћа заражених Ц. цоццодес (Белов ет ал., 2018). У Краснодарској и Приморској територији, Московској области, пронашли смо плодове парадајза, из којих смо успели да изолујемо чисте културе Ц. цоццодес. Могуће је да је Ц. цоццодес много раширенији на парадајзу у Русији него што се сада верује, а његова штетност је такође потцењена.
Тако је до данас прикупљено довољно информација о широко распрострањеној Ц. цоццодес на кромпиру и парадајзу.
Да би се боље разумела улога ове гљиве у развоју болести кромпира и парадајза, неопходно је пратити њену распрострањеност у Русији, проучити улогу инфекција тла и семена и улогу црне пеге у губицима током складиштења. Употреба ПЦР дијагностике може значајно олакшати овај рад, а истовремена употреба оба система за тестирање значајно ће повећати тачност анализе.
Овај рад подржао је грант Руске фондације за науку бр. 18-76-00009.
Чланак је објављен у часопису „Микологија и фитопатологија“ (том 54, бр. 1, 2020).