ЈЕДИ. Цхудинова, В.А. Платонов, А.В. Александрова, С.Н. Елански
Недавно се показало да је аскомицетна гљива Илионецтриа црасса способна да нападне кртоле кромпира. Овај рад је први који је анализирао биолошке карактеристике и отпорност на одређене фунгициде соја И. црасса изолованог из кромпира. Секвенце специфичних региона соја „кромпир” поклопиле су се са онима добијеним раније за гљиве изоловане из корена нарциса, гинсенга, јасике и букве, луковица љиљана и листова тулипана. Очигледно, многе дивље и баштенске биљке могу бити резерве за И. црасса. Проучени сој је заразио кришке парадајза и кромпира, али није заразио цео плод парадајза или нетакнут кртол кромпира. Ово показује да је И. црасса паразит ране. Процена резистенције на флудиоксонил, дифеноконазол и азоксистробин на хранљивом медијуму показала је високу ефикасност ових лекова.
Индикатор ЕЦ50 (концентрација фунгицида која успорава за 2 пута брзину радијалног раста колоније у односу на не-фунгицидну контролу) била је једнака 0.4; 7.4 и 4 мг/л, респективно. Приликом фитопатолошке процене кртола кромпира и развијања мера заштите биља треба узети у обзир могућност развоја болести изазване И. црасса.
Развој фитопатогених микроорганизама доводи до великих губитака у свим фазама узгоја и складиштења кромпира. Приликом планирања заштитних мера, по правилу се узимају у обзир познати узрочници болести, као што су врсте родова Алтернариа, Фусариум, Пхома, Хелминтхоспориум, Цоллетотрицхум, Пхитопхтхора и др. Међутим, последњих година све је више извештаја. о појави нових фитопатогених микроорганизама на кромпиру. Њихова биологија је слабо проучавана, ефикасност фунгицида који се користе на кромпиру против њих је непозната, а дијагностичке методе нису развијене. Када се масовно развију, они су способни да изазову значајну штету усеву кромпира. Један од ових микроорганизама је аскомицетна гљива Илионецтриа црасса (Волленв.) А. Цабрал & Цроус, коју су аутори први открили на кртолима кромпира (Цхудинова ет ал., 2019).
У овом раду су приказани резултати анализе соја И. црасса изолованог из кртола кромпира. Проучавана је морфологија колонија и мицелијских структура И. црасса, нуклеотидне секвенце специфичних ДНК пресека врсте, вирулентност на кромпир и парадајз и отпорност на неке популарне фунгициде.
материјали и методе
Сој коришћен у овом раду је И. црасса 18КСуПТ2, изолован 2018. године из зараженог кртола кромпира гајеног у Костромском региону. Кртола је била захваћена сувом трулежом са шупљином прекривеном светлосмеђим мицелијумом. Коришћењем стерилне игле за сецирање, мицелијум гљивице је пребачен у Петријеву посуду са агар медијумом (пивска сладовина 10%, агар 1.5%, пеницилин 1000 јединица/мл). Посуде су инкубиране у мраку на 24°Ц.
За фотографисање, процену величине и морфологије спора и спорулационих органа коришћени су светлосни микроскоп Леица ДМ2500 са ИЦЦ50 ХД дигиталном камером и бинокуларни микроскоп Леица М80 са дигиталном камером ИЦ80ХД (Леица Мицросистемс, Немачка).
Да би се изоловала ДНК, мицелијум гљивице је узгајан у течном медијуму грашка, затим замрзнут у течном азоту, хомогенизован, инкубиран у ЦТАБ пуферу, пречишћен хлороформом и два пута испран са 2% алкохола.
Метода екстракције ДНК је детаљно описана у чланку Кутузова ет ал. (2017).
Да би се утврдио идентитет врсте молекуларним методама и поређење са другим познатим сојевима И. црасса, ПЦР је изведен са прајмерима који су омогућили амплификацију ДНК региона специфичних за врсту: ИТС1-5,8С-ИТС2 (прајмери ИТС5/ИТС4, Вхите ет ал., 1990), региони б гена -тубулин (Бт2а/Бт2б, Гласс и Доналдсон, 1995) и фактор елонгације транслације 1α (теф1α) (прајмери ЕФ1-728Ф/ЕФ1-986Р, Царбоне и Кохн, 1999). Ампликони потребне дужине су екстраховани из гела коришћењем ЦлеанУп комплета из Еврогена. Амплификовани региони су секвенционирани коришћењем БигДие®Терминатор в3.1 комплета за секвенцирање циклуса (Апплиед Биосистемс, Калифорнија, САД) на Апплиед Биосистемс 3730 кл аутоматизованом секвенцеру (Апплиед Биосистемс, Калифорнија, САД). Добијене нуклеотидне секвенце коришћене су за тражење подударања у бази података ГенБанк америчког Националног центра за биотехнолошке информације (НЦБИ). Филогенетска анализа је урађена коришћењем програма МЕГА 6 (Тамура ет ал., 2013).
Одређивање вируленције је вршено на целим зеленим плодовима крупноплодног парадајза (сорта Дубрава) и кртола кромпира (сорта Гала). Поред тога, за симулацију оштећења оштећених плодова и кртола коришћене су кришке истих плодова и кртола. Кришке гомоља су стављене у влажне коморе, које су биле Петријеве посуде са мокрим филтер папиром на дну. На папир је постављен стаклени дијапозитив, на који су, заузврат, стављене кришке кртола или воћа. Цели кртоли и плодови су такође стављени у посуде са мокрим филтер папиром на дну. Комад агара (5×5 мм) са гљивичним хифама стављен је у центар пресека (или на неоштећену површину кртола или плода) са хифама гљива након 5 дана култивације на агару од сладовине.
Отпорност сојева гљивица на фунгициде процењивана је у лабораторијским условима на агар хранљивој подлози. Проучавали смо осетљивост на фунгицидне лекове Маким, КС (активни састојак флудиоксонил, 25 г/л), Куадрис, КС (азоксистробин 250 г/л), Скор, ЦЕ (дифеноконазол 250 г/л) (Државни каталог..., 2020. ). Оцењивање је вршено у Петријевим посудама на подлози од сладовине-агар уз додатак испитиваних лекова у концентрацији активне супстанце од 0.1; 1; 10 ппм (мг/л) (за флудиоксонил и дифеноконазол), 1; 10; 100 ппм (за азоксистробин) и на медијуму без фунгицида (контрола). Фунгицид је додат у растопљени и охлађен на 60 °Ц медијум, након чега је медијум сипан у Петријеве посуде. Блок агара са гљивичним мицелијумом стављен је у центар Петријеве посуде и култивисан на температури од 24 °Ц у мраку. После 7 дана инкубације, пречници колонија су мерени у два међусобно окомита правца; резултати мерења за сваку колонију су усредњени. Експерименти су изведени у три примерка. На основу резултата испитивања израчунат је индекс ЕЦ50, једнак концентрацији фунгицида која је преполовила брзину радијалног раста колоније у односу на нефунгицидну контролу.
Резултати и дискусија
На Петријевим посудама са агаром од сладовине, гљива је формирала колоније са белим љускавим мицелијумом. Подлога испод мицелијума је постала црвено-браон. Када се подлога осушила, гљива је формирала две врсте спора на појединачним конидиофорима и оне агрегиране у мали спородохијум. Макрокондије су издужене, цилиндричне, са једном до три преграде, просечне дужине 27.2 µм са распоном вредности од 23.2 до 32.2 µм, ширине до 4.9 µм (Сл. 1). Просечна дужина микроконидије је 14.3 µм са распоном вредности од 10.3 до 18.1 µм, ширина - до 4.0 µм. Сви макро- и микроморфолошки карактери спадају у опсег варијације врсте Илионецтриа црасса (Цабрал ет ал., 2012).
Секвенце ДНК региона специфичних за врсту (ИТС, б-тубулин, ТЕФ 1α) потпуно су се поклапали са секвенцама сојева И. црасса које смо претходно проучавали (Цхудинова ет ал., 2019, Табела 1). У циљу проучавања преваленције И. црасса у другим регионима и анализе спектра захваћених усева, сличне ДНК секвенце су анализиране у бази података ГенБанк (Табела 1). Преклапање се кретало од 86 до 100%. Секвенце сва три ДНК региона "кромпировог" соја И. црасса биле су идентичне секвенцама сојева изолованих из луковица љиљана и корена нарциса у Холандији и из корена гинсенга у Канади. Нисмо успели да пронађемо ниједан други сој И. црасса са три анализиране сличне секвенце у отвореним базама података. Међутим, анализа депонованих секвенци ИТС и б-тубулина открила је присуство И. црасса на листовима тулипана у Великој Британији. Гљиве са сличном ИТС секвенцом идентификоване су приликом анализе микобиоте корена јасике у Канади и букве у Италији и кртола кромпира у Саудијској Арабији (Табела 1). Резултати овог истраживања показују да И. црасса има глобалну распрострањеност и да је способна да напада различите биљне врсте.
Приликом утврђивања патогености на кришкама парадајза и кромпира 5. дана, пречник лезије достигао је 1.5 цм.Истовремено, испитивани сој није инфицирао цео плод парадајза или нетакнут кртол кромпира. Међутим, на парадајзу је примећено оштећење сепала. Да би се искључила могућност контаминације, изолат гљивице је изолован у чисту културу из мицелија који се развио на кришку кртола кромпира. Био је потпуно идентичан родитељском соју. Чини се да је И. црасса паразит ране.
Третирање семенских кртола фунгицидима пред садњу може смањити развој болести на биљкама током вегетације. За одабир ефикасних фунгицида важно је проценити који су ефикасни против И. црасса. У раду су проучавани широко коришћени активни састојци фунгицида - флудиоксонил, азоксистробин, дифеноконазол. Флудиоксонил је део неколико мешаних препарата који се користе за третирање семена и семенских кртола пре садње. Флудиоксонил (Маким) се такође користи за третирање семенских кртола пре складиштења. Дифеноконазол и азоксистробин су такође укључени у низ препарата који се користе за прераду семенског материјала, као и у препарате намењене преради вегетативних биљака (Државни каталог..., 2020).
Проучавана је брзина раста И. црасса на подлогама (слика 2) са различитим концентрацијама активних састојака: флудиоксонил (ЕЦ50 = 0.4 ппм), азоксистробин (ЕЦ50 = 4 ппм) и дифеноконазол (ЕЦ50 = 7.4 ппм) (Табела 2). . Ови лекови се могу сматрати високо ефикасним против И. црасса, пошто је њихова ЕЦ50 значајно нижа од препоручене концентрације лека у радној течности која се користи за третирање кртола. Према Државном каталогу... (2020), концентрација флудиоксонила у течности за третирање кртола кромпира креће се од 500 до 1000 ппм, азоксистробина (у течности за третирање дна бразде) – 3750–9375 ппм, дифеноконазола. (у течности за третирање вегетативних биљака) – 187.5–625 ппм.
Табела 1. Сличност секвенци између специфичних секвенци соја 18КСуПТ2 и сојева Илионецтриа црасса доступних у бази података Генбанк
Процедити | Биљка домаћин, место излучивања | Редни бројеви депоновани у ГенБанк, проценат сличности | Линк | ||
ЊЕГОВО | β-тубулин | ТЕФ 1α | |||
17КСПТ1 и 18КСуПТ2 | Кртола кромпира, Костромска област. | МХКСНУМКС | МХКСНУМКС | МККСНУМКС | Чудинова и др., 2019, овај рад |
ЦБС 158/31 | Корени нарциса, Холандија | ЈФКСНУМКС 100 | ЈФКСНУМКС 100 | ЈФКСНУМКС 99.3 | Цабрал ет ал., 2012 |
ЦБС 139/30 | Луковица љиљана, Холандија | ЈФКСНУМКС 100 | ЈФКСНУМКС 99.7 | ЈФКСНУМКС 99.3 |
|
НСАЦ-СХ-1 | Корен гинсенга, Канада | АИКСНУМКС 99.4 | ЈФКСНУМКС 100 | ЈФ735/725 99.6 |
|
РХС235138 | Лист тулипана, Велика Британија | КЈКСНУМКС 100 | КЈКСНУМКС 100 | НД | Дентон, Дентон, 2014 |
МТКСНУМКС | Аспен корени, Канада | МТКСНУМКС 100 | НД | НД | Рамсфиелд ет ал., 2020 |
ЕРКСНУМКС | Буц, Италија | КРКСНУМКС 99.65 | НД | НД | Тиззани, Хаеги, Мотта. Директно подношење |
КАУФ19 | Кртола кромпира, Саудијска Арабија | ХЕКСНУМКС 98.3 | НД | НД | Гашгари, Гербави, 2013 |
НД = није депоновано
Табела 2. Резистенција Илионецтриа црасса на фунгициде
(активна супстанца) | ЕЦ50, ппм | ||||
КСНУМКС дан | КСНУМКС дан | КСНУМКС дан | |||
Контролишите | КСНУМКС КСНУМКС ± | КСНУМКС КСНУМКС ± | КСНУМКС КСНУМКС ± | ||
Куадрис, КС (фзоксистробин) | КСНУМКС КСНУМКС ± | КСНУМКС КСНУМКС ± | КСНУМКС КСНУМКС ± | ||
КСНУМКС КСНУМКС ± | КСНУМКС КСНУМКС ± | КСНУМКС КСНУМКС ± | |||
КСНУМКС КСНУМКС ± | КСНУМКС КСНУМКС ± | КСНУМКС КСНУМКС ± | |||
Максим, КС (флудиоксонил) | КСНУМКС КСНУМКС ± | КСНУМКС КСНУМКС ± | КСНУМКС КСНУМКС ± | ||
КСНУМКС КСНУМКС ± | КСНУМКС КСНУМКС ± | КСНУМКС КСНУМКС ± | |||
КСНУМКС КСНУМКС ± | КСНУМКС КСНУМКС ± | КСНУМКС КСНУМКС ± | |||
Резултат, ЕЦ (дифеноконазол) | КСНУМКС КСНУМКС ± | КСНУМКС КСНУМКС ± | КСНУМКС КСНУМКС ± | ||
КСНУМКС КСНУМКС ± | КСНУМКС КСНУМКС ± | КСНУМКС КСНУМКС ± | |||
КСНУМКС КСНУМКС ± | КСНУМКС КСНУМКС ± | КСНУМКС КСНУМКС ± |
У нашем раду, сојеви И. црасса су изоловани из кртола кромпира у Костромској и Московској области (Цхудинова ет ал., 2019). Висок удео сојева гљивица са ИТС секвенцама идентичним са И. црасса идентификован је приликом анализе микобиоте кртола кромпира у Саудијској Арабији (Гасхгари и Гхербави, 2013). Очигледно, И. црасса није тако ретка на кромпиру као што се чини. Наши експерименти су показали да гљивица може да зарази оштећене плодове парадајза. Из литературе је познато да је И. црасса способна да се сапротрофно развија у земљишту (Молл ет ал., 2016), а такође и да инфицира велики број биљака, чак и оних тако удаљених у таксономском смислу као што су нарциси, љиљани, гинсенг, јасика и буква (табела 1). Очигледно, многе дивље и баштенске биљке могу бити резерве за И. црасса. Наведено показује да је приликом израде заштитних мера потребно узети у обзир могућност оштећења кртола кромпира овом гљивом. Широко коришћени препарати за третирање кртола кромпира, који садрже флудиоксонил, азоксистробин и дифеноконазол, показали су високу фунгицидну ефикасност против И. црасса.
Рад је подржала Руска фондација за основна истраживања (грант бр. 20-016-00139).
Чланак је објављен у часопису „Билтен заштите биља“, 2020, 103(3)