С.Н. Елански, Л.Иу. Кокаева, Н.В. Статсиук, Иу.Т. Диаков
Увод
Оомицете Пхитопхтхора инфестанс (Монт.) де Бари, узрочник касне пламењаче, економски најзначајније болести кромпира и парадајза, више од век и по привлачи велику пажњу истраживача из различитих земаља. Изненада се појавивши у Европи средином 19. века, изазвао је епидемију кромпира која је остала у сећању многих генерација.
До данас се често назива „ирска печурка глади“. Скоро сто година након првих епидемија откривене су дивље мексичке врсте кромпира отпорне на пламењачу, развијене су методе за њихово укрштање са култивисаним кромпиром (Муллер, 1935), и добијене су прве сорте отпорне на касну пламењачу (Пушкарев, 1937). . Међутим, убрзо након почетка њиховог комерцијалног узгоја, нагомилале су се расе патогена касне пламењаче које су биле вирулентне на отпорне сорте. а нови гени отпорности уведени у сорте дивљег мексичког кромпира почели су брзо да губе своју ефикасност.
Неуспеси у коришћењу моногене (вертикалне) отпорности приморали су одгајиваче да траже сложеније начине да искористе неспецифичну полигену (хоризонталну) отпорност. Последњих година у одређеним популацијама паразита почеле су да се акумулирају веома агресивне расе, изазивајући ерозију чак и неспецифичне отпорности. Појава сојева отпорних на фунгициде изазвала је проблеме у употреби хемијских средстава за заштиту кромпира.
Због значајних разлика између оомицета и гљива у хемијском саставу, ултраструктури и метаболизму, фунгициди, посебно системски, који се користе за заштиту биљака од многих гљивичних болести, су неефикасни против оомицета.
Због тога су у хемијској заштити од касне пламењаче коришћена вишеструка (до 12 пута у сезони или више) прскања контактним препаратима широког спектра. Револуционарни корак је била употреба фениламида, који су токсични за оомицете и системски распоређени у биљкама. Међутим, њихова широка употреба брзо је довела до акумулације резистентних сојева у популацијама гљива (Давидсе ет ал., 1981), што је значајно отежало заштиту биља. П. инфестанс је практично једини паразит умереног појаса, чија се штета не може неутралисати у условима органске пољопривреде без употребе хемијских средстава заштите (Ван Бругген, 1995).
Наведено објашњава огромну пажњу коју истраживачи из различитих земаља посвећују проучавању популација П. инфестанс, динамике њихове бројности и генетског састава, као и генетских механизама варијабилности.
Животни циклус Р. ИНФЕСТАНС
Оомицет Пхитопхтхора инфестанс развија међућелијски мицелијум са хаусторијом унутар листова кромпира. Храњењем лисним ткивом изазива стварање тамних пега, које по влажном времену поцрне и труну. Са тешким оштећењем, цео лист умире. Након периода храњења, на мицелијуму се формирају израслине - спорангиофори - који расту ка споља кроз стомате. По влажном времену формирају бели премаз око пега на доњој страни листова. На крајевима спорангиофора формирају се зооспорангије у облику лимуна, које се одвајају и носе се прскањем кише (сл. 1). Улазећи у капљице воде на површини листа кромпира, спорангије клијају у 6-8 зооспора, које после одређеног периода кретања постају заобљене, прекривене мембраном и клијају у заметну цев. Клица продире у ткиво листа кроз стомате. Под одређеним условима, спорангијум може да расте са заметном цевчицом директно у ткиво листа. Под повољним условима, време од инфекције до формирања нове спорулације је само 3-4 дана.
Једном када се нађу на земљи и филтрирају кроз земљу, спорангије су способне да заразе кртоле. Јако погођени кртоли труну током складиштења; у слабо погођеним подручјима инфекција може трајати до следеће сезоне. Поред тога, узрочник касне пламењаче може преживети зими у облику ооспора (полних спора дебелих зидова) у земљишту на биљним остацима и на семену парадајза. Ооспоре се формирају на живим биљним органима када се сојеви различитих типова парења сусрећу са вишком влаге. У пролеће се формира асексуална спорулација на засађеним кртолама и на биљним остацима са ооспорама улазе у земљиште и изазивају инфекцију доњих листова биљака. У неким случајевима, мицелијум може израсти из заражене гомоље дуж зеленог дела биљке и обично се јавља у горњем делу стабљике.
Озбиљна разлика између оомицета и већине гљива је превласт диплофазе у њиховом животном циклусу са гаметичком мејозом и клијањем зигота (ооспора) без редукције нуклеарне деобе. Ова карактеристика, плус диполарни хетеротализам, који замењује бисексуалност, чини се да омогућава примену на оомицете приступа развијених за проучавање популација виших еукариота (анализа панмиксије и подела популација, интра- и интерпопулацијски токови гена, итд.). Међутим, три фактора спречавају да се ови приступи у потпуности пренесу на проучавање популација П. инфестанс.
1. Уз хибридне ооспоре, у популацијама се формирају самооплодне и партеногенетичке ооспоре (Фифе, Схав, 1992; Аникина ет ал., 1997а; Савенкова, Черепникоба-Анирина, 2002; Смирнов, 2003), и учесталост њиховог формирања. може бити довољно да утиче на резултате испитивања.
2. Сексуални процес код П. инфестанс даје незнатан допринос динамици популације, јер се гљива размножава углавном вегетативним спорама, формирајући резултате ПЦР анализе употребом специфичних прајмера више од 90% поклапа се са резултатима анализе типа парења у традиционалном начин на хранљиву подлогу . вегетација неколико генерација асексуалне спорулације (полициклични развој болести). Ооспоре играју важну улогу у очувању организма у периоду када нема зелених биљака (зима) и у примарној зарази расада. Затим, током лета, долази до клонске репродукције и повећања или, обрнуто, смањења броја појединачних клонова који настају као резултат полне рекомбинације, што је одређено углавном одабиром прикладнијих. Дакле, однос појединачних клонова у популацији на почетку и на крају епифитотије може бити потпуно различит.
3. Описани циклус је типичан за аутохтоне популације П. инфестанс у њиховој домовини – Централној Америци. У другим областима света, сексуални процес је био непознат више од 100 година, фаза презимљавања била је вегетативни мицелијум у зараженим кртолама кромпира. Животни циклус је био потпуно агамни, а ширење је било жаришне природе: инфекција из појединачних заражених засађених кртола ширила се на листове, формирајући примарне жариште болести, које би се могло спојити са масовним развојем болести.
Тако у неким регионима може доћи до смењивања сексуалних и асексуалних циклуса, док у другим може постојати само асексуални циклус.
Порекло П. ИНФЕСТАНС
П. инфестанс се у Европи појавио крајем прве половине 1991. века. Пошто је кромпир пореклом из североисточне Јужне Америке, претпостављало се да је паразит одатле донет у Европу током бума чилеанске шалитре. Међутим, студије спроведене на станици кромпира Рокфелер центра у долини Толука (Мексико) натерале су да се преиспита ова тачка гледишта (Ниедерхаусер, 1993, XNUMX).
1. У долини Толуке, локалне врсте гомољастог кромпира (Соланум демиссум, С. булбоцастанум, итд.) имају различите скупове гена вертикалне резистенције у комбинацији са високим нивоом неспецифичне резистенције, што указује на дугорочну коеволуцију са паразитом. Јужноамеричке врсте, укључујући култивисани кромпир, немају гене отпорности.
2. У долини Толуке налазе се изолати са типовима парења А1 и А2, услед чега је распрострањена укрштана популација П. инфестанс; док се у домовини култивисаног кромпира, у Јужној Америци, паразит шири клонски.
3. Долина Толуке доживљава озбиљне годишње епидемије касне куге. Због тога међу северноамеричким истраживачима (Универзитет Корнел) постоји утврђено мишљење о Мезоамерики (Централна Америка) као домовини кромпирове каше (Гоодвин ет ал., 1994).
Јужноамерички истраживачи не деле ово мишљење. Они верују да култивисани кромпир и њихов паразит П. инфестанс имају заједничку домовину - јужноамеричке Анде. Своју тачку гледишта поткрепили су молекуларним студијама о анализи ДНК полиморфизама митохондријалног генома (мтДНК) и нуклеарних гена РАС и β-тубулина (Гомез-Алпизар ет ал., 2007). Они су показали да сојеви прикупљени са различитих локација широм света потичу из три различите лозе предака, од којих су све три пронађене у јужноамеричким Андима. Андски хаплотипови су потомци две лозе: изолати најстарије лозе мтДНК налазе се на дивљим велебиљима из секције Анаррхицоменум у Еквадору, изолати друге лозе су чести на кромпиру, парадајзу и дивљим велебиљима. У Толуци, чак и ретки хаплотипови су изведени из само једне лозе, при чему генетска варијабилност сојева Толуца (ниска алелна учесталост неких варијабилних места) указује на снажан ефекат оснивача због недавног одступања.
Поред тога, у Андима је пронађена нова врста П. андина, морфолошки и генетски слична П. инфестанс, што, према ауторима, указује на Анде као жариште за специјацију у роду Пхитопхтхора. Коначно, у Европи и Сједињеним Државама, популације П. инфестанс обухватају обе андске лозе, док у Толуци само једну.
Ова публикација је изазвала одговор групе истраживача из различитих земаља који су извршили опсежан експериментални рад на ревизији претходне студије (Госс ет ал., 2014). У овом раду, као прво, коришћене су информативније микросателитске ДНК секвенце за проучавање ДНК полиморфизама; друго, за анализу груписања, миграционих путева, времена дивергенције популација итд. коришћени су напреднији модели (Ф-статистика, Бајесове апроксимације, итд.) и, треће, коришћено је поређење не само са андском врстом П. андина, код које је утврђена хибридна природа (П. инфестанс к Пхитопхтхора сп.) , али и са мексичким ендемима П. мирабилис, П. Ипомоеае и Пхитопхтхора пхасеоли, који су генетски блиски П. инфестанс и припадају истој клади (Кроон ет ал., 2012). Као резултат ових анализа, јасно се показало да коренски део филогенетског стабла свих врста из рода Пхитопхтхора обухваћених истраживањем, осим хибрида П. андина, припада мексичким сојевима, а миграциони ток има правац Мексико – Анди, а не обрнуто, а његов почетак се поклапа са европском колонизацијом Новог света (пре 300-600 година). Тако је до појаве врсте П. инфестанс, специјализоване за оштећења кромпира, дошло у секундарном генетском центру формирања гомољастих велебиља, тј. у Централној Америци.
Геном П. инфестанс
Године 2009. међународни тим научника је секвенцирао комплетан геном П инфестанс (Хаас ет ал, 2009), чија је величина била 240 Мб. То је неколико пута више него код блиско сродних врста П. сојае (95 Мб), која изазива трулеж корена соје, и П. Раморум (65 Мб), која погађа вредне врсте дрвећа као што су храст, буква и неке друге. Добијени подаци су показали да геном садржи велики број копија понављајућих секвенци – 74%. Геном садржи 17797 гена који кодирају протеине, од којих су већина гени укључени у ћелијске процесе, укључујући репликацију ДНК, транскрипцију и транслацију протеина.
Упоређивање генома рода Пхитопхтхора открило је необичну организацију генома, која се састоји од блокова конзервираних генских секвенци, у којима је густина гена релативно висока, а садржај поновљених секвенци релативно низак, а појединачни региони са неконзервираним секвенцама гена. , са малом густином гена и високим садржајем поновљених региона. Конзервирани блокови чине 70% (12440) свих гена који кодирају протеине у П. инфестанс. Унутар очуваних блокова, гени су обично блиско лоцирани са просечном међугенском раздаљином од 604 бп. У регионима између конзервираних блокова, међугенско растојање је веће (3700 бп) због повећања густине понављајућих елемената. Ефекторски секреторни гени који се брзо развијају налазе се у регионима са ниским обиљем гена.
Анализа секвенци генома П. инфестанс показала је да приближно једна трећина генома припада транспозивним елементима. Геном П. инфестанс садржи значајно више различитих породица транспозона од других познатих генома. Већина транспозона у П. инфестанс припада породици Цигана.
Геном П. инфестанс открио је велики број специфичних породица гена укључених у патогенезу. Значајан део њих кодира ефекторске протеине који мењају физиологију биљке домаћина и доприносе њеној инфекцији. Они спадају у две широке категорије: апопластични ефектори, који делују у међућелијским просторима (апопласти) и цитоплазматски ефектори, који улазе у ћелије преко хаусторије. Апопластични ефектори укључују излучене хидролитичке ензиме као што су протеазе, липазе и гликозилазе који уништавају биљне ћелије; инхибитори одбрамбених ензима биљних домаћина и некротизирајућих токсина као што су протеини слични Неп1 (НПЛ) и мали протеини богати цистеином (СЦР) слични Пцф-у.
Ефекторски гени П. инфестанс су бројни и обично веће величине у поређењу са непатогеним генима. Најпознатији цитоплазматски ефектори су РКСЛР и Цринклер (ЦНР). Типични цитоплазматски ефектори за оомицете су РКСЛР протеини. Сви до сада откривени ефекторски гени РКСЛР садрже амино-терминалну групу Арг-КСЛеу-Арг, где Кс представља аминокиселину. Студија је сугерисала присуство 563 РКСЛР гена у геному П. инфестанс, што је 60% више од П. сојае и П. раморум. Приближно половина РКСЛР гена у геному П. инфестанс је специфична за врсту. РКСЛР ефектори имају широк избор секвенци. Међу њима је идентификована једна велика и 150 малих породица. За разлику од протеома језгра, РКСЛР ефекторски гени се обично налазе у геном сиромашним регионима генома богатим понављањем. Преносиви елементи који чине ове регионе динамичним промовишу рекомбинацију у овим генима.
Цитоплазматски ЦРН ефектори су првобитно идентификовани у транскриптима П. инфестанс који кодирају пептиде који индукују некрозу биљног ткива. Од њиховог открића, мало се зна о породици ових ефектора. Анализа генома П. инфестанс открила је огромну породицу од 196 ЦРН гена, значајно веће од гена П. сојае (100 ЦРН) и П. раморум (19 ЦРН). Као и РКСЛР, ЦРН су модуларни протеини и састоје се од високо очуваног Н-терминалног ЛФЛАК домена (50 аминокиселина) и оближњег ДВЛ домена који садржи различите гене. Већина ЦРН-ова (60%) поседује сигнални пептид.
Проучен је потенцијал различитих ЦРН-ова да поремете ћелијске процесе биљке домаћина. У анализи некрозе биљака, уклањање ЦРН2 протеина је омогућило да се идентификује Ц-терминални регион који се састоји од 234 аминокиселине (позиције 173-407, ДКСГ домен) који изазива ћелијску смрт. Анализа ЦРН гена П. инфестанс открила је четири различита Ц-терминална региона који такође узрокују ћелијску смрт у биљци. Ово укључује прве идентификоване ДЦ домене (П. инфестанс има 18 гена и 49 псеудогена), као и Д2 (14 и 43) и ДБФ (2 и 1) домене, који су слични протеин киназама. Протеини ЦРН домена експримирани у биљкама опстају (у одсуству сигналних пептида) у биљној ћелији и стимулишу ћелијску смрт кроз интрацелуларни механизам. Још 255 секвенци које садрже ЦРН домен вероватно не функционишу као гени.
Повећање броја и величине фамилија РКСЛР и ЦРН ефекторских гена је вероватно последица неалелне хомологне рекомбинације и дупликације гена. Упркос чињеници да геном садржи велики број активних транспобилних елемената, још увек нема директних доказа о преносу ефекторских гена.
Методе коришћене у проучавању структуре становништва
Проучавање генетске структуре популација тренутно се заснива на анализи чистих култура њених саставних сојева. Анализа популација без изоловања чистих култура се такође спроводи у одређене сврхе, као што је, на пример, проучавање агресивности популације или присуства сојева отпорних на фунгициде у њој (Филиппов и сар., 2004, Деревиагина и сар., 1999). Ова врста истраживања подразумева коришћење посебних метода, чији опис је ван оквира овог прегледа. За упоредну анализу сојева користи се низ метода, заснованих како на анализи структуре ДНК, тако и на проучавању фенотипских манифестација. Приликом упоредне анализе популација потребно је имати посла са великим бројем изолата, што намеће одређене захтеве за методе које се користе. У идеалном случају, требало би да испуњавају следеће захтеве (Цооке, Леес, 2004, Муеллер, Волфенбаргер, 1999):
- да буду јефтини, лаки за имплементацију, не захтевају значајно време и да буду засновани на јавно доступним технологијама (на пример, ПЦР);
— мора да генерише довољно велики број независних кодоминантних обележја;
— имају високу репродуктивност;
— користите минималну количину ткива које се испитује;
— бити специфичан за супстрат (контаминација присутна у култури не би требало да утиче на резултате);
- не захтевају употребу опасних поступака и високо токсичних хемикалија.
Нажалост, не постоје методе које задовољавају све горе наведене параметре. За упоредно проучавање сојева сада се користе методе засноване на анализи фенотипских карактеристика: вируленције на сорте кромпира и парадајза (расе кромпира и парадајза), типа парења, спектра изоензима пептидазе и глукоза-6-фосфат изомеразе и анализе Структура ДНК: анализа рестрикционих фрагмената полиморфизма дужине (РФЛП), која се обично допуњава РГ 57 хибридизационом сондом, анализа микросателитских понављања (ССР и ИнтерССР), амплификација са случајним прајмерима (РАПД), амплификација рестрикционих фрагмената (АФЛП), амплификација са прајмерима хомологне секвенцама преносивих елемената (на пример, Интер СИНЕ ПЦР), одређивање хаплотипова митохондријске ДНК.
Кратки описи метода за упоредно проучавање сојева коришћених у раду са П. инфестанс
Фенотипске маркерске особине
Трке „кромпира“.
Трке „кромпира” су често истражен и коришћен маркер. “Једноставне” расе кромпира имају један ген вируленције кромпира, “сложене” расе имају најмање два. Блацк ет ал (1953), сумирајући све доступне податке, утврдили су да је раса Пхитопхтхора способна да нападне биљке са геном/генима отпорности који одговарају гену/генима вируленције П. инфестанс и открили су расе 1, 2. , 3 и 4 које инфицирају биљке генима Р1, Р2, Р3 и Р4, тј. Интеракција између паразита и домаћина одвија се по принципу „ген за ген“. Даље, Блек је, уз учешће Галеглија и Малколмсона, открио гене отпорности Р5, Р6, Р7, Р8, Р9, Р10 и Р11, као и њихове одговарајуће расе (Блацк, 1954; Блацк & Галлегли, 1957; Малцолмсон & Блацк , 1966, Малцолмсон, 1970);
Постоји широк спектар података о расном саставу патогена из различитих региона. Без детаљне анализе ових података, указаћемо само на општи тренд: тамо где су коришћене сорте са новим генима отпорности или њихове комбинације, у почетку је дошло до извесног слабљења касне пламењаче, да би се потом појавиле расе са одговарајућим генима вируленције које су селектоване, и поново су настављене избијања касне мрље. Специфична вирулентност према прва 4 гена отпорности (Р1-Р4) ретко је примећена у колекцијама прикупљеним пре увођења сорти са овим генима у култивацију, али се број вирулентних сојева нагло повећао када је патоген паразитирао на сортама које носе ове гене. Гени 5-11 су се, напротив, често налазили у збиркама (Схав, 1991).
Студија односа различитих раса током вегетације, спроведена крајем осамдесетих година прошлог века, показала је да на почетку развоја болести у популацији преовлађују клонови ниске агресивности и 1980-1 гена вируленције.
Даље, како се касна флека развија, концентрација почетних клонова се смањује и повећава се број „сложених“ раса са високом агресивношћу. Инциденција последњег достиже 100% до краја сезоне. Приликом складиштења кртола долази до смањења агресивности и губитка појединачних гена вируленције. Динамика замене клонова може се разликовати код различитих варијанти (Рибакова & Диаков, 1990). Међутим, наше студије спроведене 2000-2010. године показале су да су сложене расе пронађене од самог почетка епифитотије међу сојевима изолованим и из кромпира и из парадајза. Ово је вероватно због промена у популацији П. инфестанс у Русији.
До 1988-1995, појава "супер раса" које имају све или скоро све гене вируленције у различитим регионима достигла је 70-100%. Ова ситуација је забележена, на пример, у Белорусији, у Лењинградској, Московској области, у Северној Осетији и у Немачкој (Иваниук ет ал., 2002а, 2002б; Политико, 1994; Сцхобер-Бутин ет ал., 1995).
Трке "парадајза".
Код сорти парадајза пронађена су само два гена за отпорност на пламењачу: Пх2 (Галлегли & Марвелл, 1) и Пх1955 (Ал-Кхерб, 2). Као иу случају раса кромпира, интеракција између парадајза и П. инфестанс се одвија по принципу „ген за ген”. Раса Т1988 инфицира сорте које немају гене отпорности (највише индустријски коришћених сорти), раса Т0 инфицира сорте Пх1 геном (Отава), раса Т1 инфицира сорте Пх2 геном.
У Русији је скоро искључиво Т0 пронађен на кромпиру; на парадајзу је на почетку сезоне преовладавао Т0, али је касније замењен расом Т1 (Диаков ет ал., 1975, 1994). После 2000. године, Т1 на кромпиру је почео да се јавља у многим популацијама на самом почетку епифитотије. У САД су на кромпиру нађени сојеви непатогени за парадајз, као и расе Т0, Т1 и Т2, док су на парадајзу преовладавали Т1 и Т2 (Вартаниан & Ендо, 1985; Гоодвин ет ал., 1995).
Тип парења
За спровођење студије потребни су тестер (референтни) сојеви са познатим типовима парења – А1 и А2. Тест изолат се сеје са њима у пару у Петријеве посуде са подлогом од зобеног агара. Након инкубације од 10 дана, посуде се испитују на присуство или одсуство ооспора у медијуму у контактној зони сојева. Постоје 4 могуће опције: сој припада типу парења А1 ако формира ооспоре са тестером А2, А2 ако формира ооспоре са тестером А1, А1А2 ако формира ооспоре са оба тестера, или је стерилан (00) ако је не формира ооспоре ни са једним тестером (последње две групе су ретке).
Да би се брже одредили типови парења, учињени су покушаји да се идентификују геномски региони повезани са типом парења, са циљем њихове даље употребе за одређивање типа парења помоћу ПЦР-а. Амерички истраживачи су били међу првима који су спровели успешан експеримент да идентификују такво место (Јуделсон ет ал., 1995). Користећи РАПД метод, успели су да идентификују регион В16 повезан са типом парења код потомака два укрштена изолата и дизајнирају пар прајмера од 24 нуклеотида да га појачају (В16-1 (5'-ААЦАЦГЦАЦААГГЦАТАТАААТГТА-3') и В16-2 (5' -ГЦГТААТГТАГЦГТААЦАГЦТТЦ-3' Након рестрикције ПЦР производа коришћењем ХаеИИИ рестрикционог ензима, било је могуће одвојити изолате са типовима парења А1 и А2).
Још један покушај да се добију ПЦР маркери за одређивање типова парења направили су корејски истраживачи (Ким и Ли, 2002). Они су идентификовали специфичне производе користећи АФЛП метод. Као резултат, развијен је пар прајмера ПХИБ-1 (напред) (5'-ГАТЦГГАТТАГТЦАГАЦГАГ-3') и ПХИБ-2 (5'-ГЦГТЦТГЦААГГЦГЦАТТТТ-3'), омогућавајући селективно појачавање региона генома повезаног са А2 тип парења. Након тога, наставили су овај рад и дизајнирали прајмере 5' ААГЦТАТАЦТГГГАЦАГГГТ-3' (ИНФ-1, напред) и 5'-ГЦГТТЦТТТЦГТАТТАЦЦАЦ-3' (ИНФ-2), омогућавајући селективно амплификацију Мат-А1 региона, карактеристичну за сојеве са тип парења А1. Употреба ПЦР дијагностике типова парења показала је добре резултате у проучавању популација П. инфестанс у Чешкој (Мазакова ет ал., 2006), Тунису (Јмоур, Хамада, 2006) и другим регионима. У нашој лабораторији (Митса, Елански, необјављено) анализирано је 34 соја П. инфестанс изолованих из захваћених органа кромпира и парадајза у различитим регионима Русије (Костромска, Рјазанска, Астраханска, Московска област). Резултати ПЦР анализе коришћењем специфичних прајмера поклопили су се за више од 90% са резултатима анализе типа парења традиционалном методом на хранљивој подлози.
Табела 1. Варијабилност резистенције унутар клона Сиб 1 (Елански ет ал., 2001)
Локација за прикупљање узорака | Број анализираних изолата | Број осетљивих (С), слабо резистентних (СР) и резистентних (Р) сојева, ком (%) | ||
S | SR | R | ||
Владивосток | 10 | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) |
Г. Цхита | 5 | 0 | 0 | КСНУМКС (КСНУМКС) |
Г. Иркутск | 9 | КСНУМКС (КСНУМКС) | 0 | 0 |
Краснојарск | 13 | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | 0 |
Јекатеринбург град | 15 | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) |
О. Сахалин | 66 | 0 | 0 | КСНУМКС (КСНУМКС) |
Омск регион | 18 | 0 | 0 | КСНУМКС (КСНУМКС) |
Отпорност на металаксил као популацијски маркер
Почетком 1980-их, у различитим регионима пријављене су тешке епидемије касне пламењаче изазване сојевима П. инфестанс отпорним на металаксил. Фарме кромпира у многим земљама претрпеле су значајне губитке (Довлеи & О'Сулливан, 1981; Давидсе ет ал., 1983; Деревиагина, 1991). Од тада, многе земље широм света континуирано прате појаву сојева отпорних на фениламиде у популацијама П. инфестанс. Поред практичне процене могућности употребе лекова који садрже фениламиде, конструисања система заштитних мера и предвиђања епифитотија, резистенција на ове лекове постала је једна од маркерских особина која се широко користи за упоредну анализу популација овог патогена. Међутим, употреба резистенције на металаксил у упоредним популационим студијама треба да буде спроведена узимајући у обзир чињеницу да: 1 - генетска основа резистенције још није прецизно утврђена, 2 - отпорност на металаксил је селективно зависна особина, способна за мењајући у зависности од употребе фениламида, 3 - различит степен осетљивости на металаксил сојева унутар једне клонске линије (Табела 1).
Спектри изоензима
Маркери изоензима су обично независни од спољашњих услова, показују менделско наслеђе и кодоминантни су, што омогућава разликовање хомо- и хетерозигота. Употреба протеина као маркера гена омогућава идентификацију како великих реорганизација генетског материјала, укључујући хромозомске и геномске мутације, тако и супституције појединачних аминокиселина.
Електрофоретске студије протеина су показале да већина ензима постоји у организмима у облику неколико фракција које се разликују по електрофоретској покретљивости. Ове фракције су резултат кодирања више облика ензима различитим локусима (изозими или изозими) или различитим алелима истог локуса (алозими или алозими). То јест, изозими су различити облици истог ензима. Различити облици имају исту каталитичку активност, али се незнатно разликују по супституцијама појединачних аминокиселина у саставу пептида и напуњености. Такве разлике се откривају електрофорезом.
Приликом проучавања сојева П. инфестанс коришћени су спектри изоензима два протеина: пептидазе и глукоза-6-фосфат изомеразе (овај ензим је мономорфан у руским популацијама, па методе за његово проучавање нису дате у овом раду). Да би се раздвојили у изозиме у електричном пољу, протеински препарати изоловани из организама који се проучавају наносе се на гел плочу постављену у електрично поље. Брзина дифузије појединачних протеина у гелу зависи од наелектрисања и молекулске тежине, па се у електричном пољу мешавина протеина раздваја у засебне фракције, које се могу визуелизовати помоћу специјалних боја.
Проучавање изоензима пептидазе се врши на целулозном ацетату, скробу или полиакриламидним геловима. Најпогоднија метода је заснована на употреби целулозно ацетатних гелова које производи Хелена Лабораториес Инц. Не захтева велике количине тест материјала, омогућава добијање контрастних трака на гелу после електрофорезе за оба локуса ензима и не захтева велике количине времена и новца (Сл. 2).
Мали комадић мицелијума се пребацује у микроепрувету од 1,5 мл и додаје се 1-2 капи дестиловане воде. Након тога, узорак се хомогенизује (на пример, електричном бушилицом са пластичним наставком погодним за микроепрувету) и седиментира 25 секунди у центрифуги на 13000 о/мин. Из сваке микроепрувете, 8 µл. супернатант се преноси на плочу апликатора.
Целулоза ацетатни гел се уклања из посуде за пуфер, упија између два листа филтер папира и ставља радним слојем окренутим нагоре на пластичну подлогу апликатора. Раствор са плоче се апликатором преноси у гел 2-4 пута. Гел се преноси у комору за електрофорезу,
Табела 2. Састав раствора који се користи за бојење целулозног ацетатног гела при анализи изоензима пептидазе: кап боје (бромфенол плава) ставља се на ивицу гела.
ТРИС ХЦл, 0,05 М, Пх 8,0 2 мл
Пероксидаза, 1000 У/мл 5 капи
о-дианисидин, 4 мг/мл 8 капи
МгЦл2, 20 мг/мл 2 капи
Гли-Леу, 15 мг/мл 10 капи
Л-амино-киселина оксидаза, 20 у/мл 2 капи
Електрофореза се изводи 20 минута. на 200 В. Након електрофорезе, гел се пребацује на сто за фарбање и фарба посебним раствором за фарбање (табела 2). 10 мл 1,6% ДИФЦО агара претходно се растопи у микроталасној пећници, охлади на 60°Ц, након чега се 2 мл агара помеша са мешавином боје и сипа на гел. Траке се појављују у року од 15-20 минута. Реагенс Л-амино-киселине оксидазе се додаје непосредно пре мешања раствора са растопљеним агаром.
У руским популацијама, локус Пеп 1 је представљен генотиповима 100/100 и 92/100. Хомозигот 92/92 је изузетно реткост (око 0,1%). Лоцус Пеп 2 је представљен са три генотипа 100/100, 100/112 и 112/112, а све 3 варијанте су прилично честе (Еланки, Смирнов, 2003, сл. 2).
Геноме Ресеарцх
Полиморфизам дужине рестрикционог фрагмента праћен хибридизацијом (РФЛП-РГ 57)
Укупна ДНК се третира рестрикцијским ензимом Ецо Р1, фрагменти ДНК се одвајају помоћу електрофорезе у агарозном гелу. Нуклеарна ДНК је веома велика и има много понављајућих секвенци, што отежава директну анализу бројних фрагмената добијених рестрикционим ензимима. Због тога се фрагменти ДНК издвојени у гелу преносе на специјалну мембрану и користе за хибридизацију са РГ 57 сондом, која садржи нуклеотиде обележене радиоактивним или флуоресцентним ознакама. Ова сонда се хибридизује са веома репетитивним секвенцама у геному (Гоодвин ет ал., 1992, Форбес ет ал., 1998). Након визуелизације резултата хибридизације на светло- или радиоактивно осетљивом материјалу, добија се мултилокусни хибридизациони профил (отисак прста), представљен са 25-29 фрагмената (Форбес ет ал., 1998). Асексуално (клонско) потомство ће имати идентичне профиле. По локацији трака на електроферограму суде се сличности и разлике организама који се пореде.
Хаплотипови митохондријске ДНК
У већини еукариотских ћелија, мтДНК је представљена у облику дволанчаног кружног молекула ДНК, који се, за разлику од нуклеарних хромозома еукариотских ћелија, реплицира полуконзервативно и није повезан са протеинским молекулима.
Митохондријски геном П. инфестанс је секвенциониран, а одређени број радова је посвећен анализи дужине рестрикционих фрагмената (Цартер ет ал, 1990, Гоодвин, 1991, Гавино и Фри, 2002). Након што су Грифит и Шо (1998) развили једноставну и брзу методу за одређивање хаплотипова мтДНК, овај маркер је постао један од најпопуларнијих у студијама П. инфестанс. Суштина методе је секвенцијална амплификација два фрагмента митохондријалне ДНК (из). заједнички геном) са прајмерима Ф2-Р2 и Ф4-Р4 (Табела 3) и њиховом накнадном рестрикцијом коришћењем рестрикционих ензима МспИ (1. фрагмент) и ЕцоР1 (2. фрагмент). Метода нам омогућава да идентификујемо 4 хаплотипа: Иа, ИИа, Иб, ИИб. Тип ИИ се разликује од типа И по присуству инсерције од 1881 бп и различитој локацији рестрикцијских места у П2 и П4 регионима (слика 3).
Од 1996. године, међу сојевима прикупљеним у Русији, забележени су само хаплотипови Иа и ИИа (Елански ет ал., 2001, 2015). Могу се идентификовати након одвајања рестрикцијских производа прајмером Ф2-Р2 у електричном пољу (сл. 4, 5). Типови мтДНК се користе у упоредним анализама сојева и популација. У бројним студијама, типови митохондријске ДНК су коришћени за идентификацију клонских линија и сертификацију изолата П. инфестанс (Ботез ет ал., 2007; Схеин ет ал., 2009). Методом ПЦР-РФЛП закључено је да је мтДНК хетерогена у истом соју П. инфестанс (Елански, Милиутина, 2007). Услови појачања: 1к (500 сек. 94°Ц), 40к (30 сек. 90°Ц, 30 сек. 52°Ц, 90 сек. 72°Ц); 1к (5 мин. 72°Ц). Реакциона смеша: (20 µл): 0,2У Так ДНК полимераза, 1к 2,5 мМ МгЦл2-Так пуфер, 0,2 мМ сваки дНТП, 30 пМ прајмера и 5 нг тест ДНК, дејонизована вода - до 20 µл.
Рестрикција ПЦР производа се спроводи 4-6 сати на температури од 37°Ц. Рестрикциона смеша (20 µл): 10к МспИ (2 µл), 10к рестрикциони пуфер (2 µл), дејонизована вода (6 µл), ПЦР производ (10 µл).
Табела 3. Прајмери који се користе за амплификацију полиморфних региона мтДНК
Лоцус | Пример | Дужина прајмера и постављање | Дужина ПЦР производа | Рестрикциони ензим |
---|---|---|---|---|
P2 | Ф2: 5'- ТТЦЦЦТТТГТЦЦТЦТАЦЦГАТ | 21; 13619-13639 | 1070 | МспИ |
Р2: 5'- ТТАЦГГЦГГТТТАГЦАЦАТАЦА | 22; 14688-14667 | |||
P4 | Ф4: 5'- ТГГТЦАТЦЦАГАГГТТТАТГТТ | 22; 9329-9350 | 964 | ЕцоРИ |
Р4: 5 - ЦЦГАТАЦЦГАТАЦЦАГЦАЦЦАА | 22; 10292-10271 |
Случајна амплификација прајмера (РАПД)
Приликом спровођења РАПД-а користи се један прајмер (понекад неколико прајмера истовремено) са произвољном секвенцом нуклеотида, обично дужине 10 нуклеотида, са високим садржајем (од 50%) ГЦ нуклеотида и ниском температуром жарења (око 35ºЦ). Такви прајмери „седе“ на бројним комплементарним местима у геному. После амплификације добија се велики број ампликона. Њихов број зависи од коришћеног прајмера и услова реакције (концентрација МгЦл2 и температура жарења).
Ампликони се визуализују трчањем на полиакриламидном или агарозном гелу. Приликом спровођења РАПД анализе потребно је пажљиво пратити чистоћу анализираног материјала, јер контаминација другим живим објектима може изазвати значајно повећање броја артефаката, који су прилично бројни чак и када се анализира чист материјал (Перез ет ал, 1998). Употреба ове методе у проучавању генома П. инфестанс се огледа у многим радовима (Јуделсон и Робертс, 1999, Гхимире ет ал., 2002, Царлисле ет ал., 2001). Избор реакционих услова и прајмера (проучавано је 51 10-нуклеотидних прајмера) дат је у чланку Абу-Ел Самена и сар., (2003).
Анализа микросателитског понављања (ССР).
Понављања микросателита (понављања једноставне секвенце, ССР) су тандемски поновљене кратке секвенце од 1-3 (понекад и до 6) нуклеотида присутних у нуклеарним геномима свих еукариота. Број узастопних понављања може да варира од 10 до 100. Микросателитски локуси се јављају са прилично високом фреквенцијом и мање-више су равномерно распоређени по целом геному (Лагерцрантз ет ал., 1993). Полиморфизам микросателитских секвенци је повезан са разликама у броју понављања основног мотива. Микросателитски маркери су кодоминантни, што им омогућава да се користе за анализу структуре популације, одређивање сродства, миграционих путева генотипова итд. Међу осталим предностима ових маркера, треба истаћи њихов висок полиморфизам, добру репродуктивност, неутралност и могућност аутоматске анализе и евалуације. У почетку је анализа спроведена одвајањем реакционих производа на полиакриламидном гелу. Касније су запослени у компанији Апплиед Биосистемс предложили употребу флуоресцентно обележених прајмера са детекцијом продукта реакције помоћу аутоматског ласерског детектора (Диехл ет ал., 1990), а затим стандардних аутоматских ДНК секвенцера (Зиегле ет ал., 1992). Означавање прајмера са различитим флуоресцентним бојама омогућава анализу неколико маркера на једној траци одједном и, сходно томе, значајно повећава продуктивност методе и побољшава тачност анализе.
Прве публикације посвећене коришћењу ССР анализе за проучавање П. инфестанс појавиле су се почетком 2000-их. (Кнапова, Гиси, 2002). Нису сви маркери које су предложили аутори показали довољан степен полиморфизма, међутим, два од њих (4Б и Г11) су укључена у скуп од 12 ССР маркера који су предложили Леес ет ал (2006) и касније прихваћени у Еуцаблигхт-у истраживачка мрежа (ввв.еуцаблигхт .орг) као стандард за П. инфестанс. Неколико година касније објављена је студија о стварању система мултиплекс ДНК анализе за П. инфестанс на основу осам ССР маркера (Ли ет ал., 2010). Коначно, након евалуације свих претходно предложених маркера и одабира најинформативнијих, као и оптимизације прајмера, флуоресцентних ознака и услова амплификације, исти тим аутора је представио систем мултиплекс анализе у једном кораку који укључује 12 маркера (Табела 4; Ли и др. , 2013а). Прајмери коришћени у овом систему су одабрани и обележени једним од четири флуоресцентна маркера (ФАМ, ВИЦ, НЕД, ПЕТ) тако да се распони величина алела прајмера са истим ознакама не преклапају.
Аутори су извршили анализу на термоциклеру ПТЦ200 (МЈ Ресеарцх, САД) користећи КИАГЕН мултиплекс ПЦР или КИАГЕН Типеит Мицросателлите ПЦР комплет. Запремина реакционе смеше била је 12.5 ул. Услови амплификације су били следећи: за КИАГЕН мултиплекс ПЦР: 95ºЦ (15 мин), 30к (95ºЦ (20 с), 58ºЦ (90 с), 72ºЦ (60 с), 72ºЦ (20 мин); за КИАГЕН Типе-ит Мицросателлите ПЦР : 95ºС (5 мин), 28х (95ºС (30 сек), 58ºС (90 сек), 72ºС (20 сек), 60ºС (30 мин).
Раздвајање и визуализација ПЦР производа извршена је коришћењем АБИ3730 аутоматизованог капиларног ДНК анализатора (Апплиед Биосистемс).
Табела 4. Карактеристике 12 стандардних ССР маркера који се користе за генотипизацију П. инфестанс (Ли ет ал., 2013а)
Име | Број алела | Распон величина алели (бп) | Прајмери |
ПиГ11 | 13 | 130-180 | Ж: НЕД-ТГЦТАТТТАТЦААГЦГТГГГ Р: ГТТТЦААТЦТГЦАГЦЦГТААГА |
Пи02 | 4 | 255-275 | Ф: НЕД-АЦТТГЦАГААЦТАЦЦГЦЦЦ Р: ГТТТГАЦЦАЦТТТЦЦТЦГГТТЦ |
ПинфССР11 | 4 | 325-360 | Ф: НЕД-ТТААГЦЦАЦГАЦАТГАГЦТГ Р: ГТТТАГАЦААТТГТТТТГТГГТЦГЦ |
ДКСНУМКС | 16 | 100-185 | Ф: ФАМ-ТГЦЦЦЦЦТГЦТЦАЦТЦ Р: ГЦТЦГААТТЦАТТТТАЦАГАЦТТГ |
ПинфССР8 | 4 | 250-275 | Ф: ФАМ-ААТЦТГАТЦГЦААЦТГАГГГ Р: ГТТТЦААГАТАЦАЦАЦГТЦГЦТЦЦ |
ПинфССР4 | 7 | 280-305 | Ф: ФАМ-ТЦТТГТТЦГАГТАТГЦГАЦГ Р: ГТТТЦАЦТТЦГГГАГАААГГЦТТЦ |
Пи04 | 4 | 160-175 | Ф: ВИЦ-АГЦГГЦТТАЦЦГАТГГ Р: ГТТТЦАГГЦГГЦТГТТТЦГАЦ |
Пи70 | 3 | 185-205 | Ф: ВИЦ-АТГААААТАЦГТЦААТГЦТЦГ Р: ЦГТТГГАТАТТТЦТАТТТЦТТЦГ |
ПинфССР6 | 3 | 230-250 | Ж: ГТТТТГГТГГГГЦТГААГТТТТ Р: ВИЦ-ТЦГЦЦАЦААГАТТТАТТЦЦГ |
Пи63 | 3 | 265-280 | Ж: ВИЦ-АТГАЦГААГАТГАААГТГАГГ Р: ЦГТАТТТЦЦТГТТТАТЦТААЦАЦЦ |
ПинфССР2 | 3 | 165-180 | Ф: ПЕТ-ЦГАЦТТЦТАЦАТЦААЦЦГГЦ Р: ГТТТГЦТТГГАЦТГЦГТЦТТТАГЦ |
Пи4Б | 5 | 200-295 | Ж: ПЕТ-ААААТАААГЦЦТТТГГТТЦА Р: ГЦААГЦГАГГТТТГТАГАТТ |
Пример визуелизације резултата анализе приказан је на Сл. 6. Резултати су анализирани коришћењем програма ГенеМаппер 3.7 упоређивањем добијених података са подацима из познатих изолата. Да би се олакшала интерпретација резултата теста, свака студија треба да укључи 1-2 референтна изолата са познатим генотипом.
Предложени метод истраживања тестиран је на значајном броју теренских узорака, након чега су аутори стандардизовали протоколе између лабораторија две организације, Тхе Јамес Хуттон Институте (Велика Британија) и Вагенинген Университи & Ресеарцх (Холандија), који, уз могућност коришћења стандардне ФТА картице за поједностављено прикупљање и отпрему узорака ДНК из П. инфестанс омогућиле су нам да говоримо о могућности комерцијалне употребе овог развоја. Поред тога, брза и тачна метода генотипизације изолата П. инфестанс коришћењем мултиплекс ССР анализе омогућила је спровођење стандардизованих студија популација овог патогена на глобалном нивоу, као и стварање глобалне базе података касне пламењаче у оквиру Пројекат Еуцаблигхт (ввв.еуцаблигхт.орг), укључујући и резултате микросателитне анализе, омогућио је праћење појаве и ширења нових генотипова широм света.
Појачани полиморфизам дужине рестрикционог фрагмента (АФЛП). АФЛП (амплифиед фрагмент ленгтх полиморпхисм) је технологија за добијање насумичних молекуларних маркера коришћењем специфичних прајмера. У АФЛП-у, ДНК се третира комбинацијом два рестрикциона ензима. Специфични адаптери су везани за лепљиве крајеве рестрикционих фрагмената.
Ови фрагменти се затим амплифицирају коришћењем прајмера који су комплементарни секвенци адаптера и рестрикцијском месту, и додатно носе једну или више насумично одабраних база на својим 3' крајевима. Скуп резултујућих фрагмената зависи од рестрикцијских ензима и насумично одабраних нуклеотида на 3' крајевима прајмера (Вос ет ал., 1995). АФЛП генотипизација се користи за брзо проучавање генетске варијабилности различитих организама.
Детаљан опис методе је дат у Муеллер, Волфенбаргер, 1999, Савелкоул ет ал., 1999. Кинески истраживачи су урадили много посла да упореде резолуцију АФЛП и ССР метода. Проучаване су фенотипске и генотипске карактеристике 48 изолата П. инфестанс прикупљених из пет региона северне Кине. АФЛП спектри су открили осам различитих ДНК генотипова, за разлику од ССР генотипова, за које није идентификована разноликост (Гуо ет ал., 2008).
Амплификација са прајмерима хомологним секвенцама преносивих елемената
Маркери изведени из ретротранспозонских секвенци су веома корисни за генетско мапирање, проучавање генетског диверзитета и еволуционих процеса (Сцхулман, 2006). Ако направите прајмере који су комплементарни стабилним секвенцама одређених мобилних елемената, можете појачати регионе генома који се налазе између њих. У студијама узрочника касне пламењаче успешно је коришћен метод амплификације секција генома применом прајмера комплементарног основној секвенци ретропазонског СИНЕ (Схорт Интерсперсед Нуцлеар Елементс) (Лаврова, Елански, 2003). Коришћењем ове методе откривене су разлике чак и код асексуалног потомства истог изолата. С тим у вези, закључено је да је интер-СИНЕ ПЦР метода високо специфична и да је брзина кретања СИНЕ елемената у геному Пхитопхтхора висока.
У геному П. инфестанс идентификовано је дванаест породица кратких ретротранспозона (СИНЕс); Проучавана је дистрибуција кратких ретротранспозона, идентификовани су елементи (СИНЕ) који се налазе само у геному П. инфестанс (Лаврова, 12).
Особине примене метода за упоредно проучавање сојева у популационим студијама
Приликом планирања студије потребно је јасно разумети циљеве које она тежи и користити одговарајуће методе. Дакле, неке методе омогућавају генерисање великог броја независних карактеристика маркера, али у исто време имају ниску репродуктивност и веома зависе од употребљених реагенса, услова реакције и контаминације материјала који се проучава. Због тога је у свакој студији групе сојева потребно користити неколико стандардних (референтних) изолата, али је и тада резултате неколико експеримената веома тешко комбиновати.
Ова група метода укључује РАПД, АФЛП, ИнтерССР, ИнтерСИНЕ ПЦР. После амплификације добија се велики број фрагмената ДНК различитих величина. Овакве технике препоручљиво је користити када је потребно утврдити разлике између блиско повезаних сојева (родитељи-потомци, дивљи тип-мутанти итд.), или у случајевима када је потребна детаљна анализа малог узорка. Дакле, АФЛП метода се широко користи у генетском мапирању П. инфестанс (ван дер Лее ет ал., 1997) и у интрапопулацијским студијама (Кнапова, Гиси, 2002, Цооке ет ал, 2003, Флиер ет ал, 2003). Није препоручљиво користити такве методе приликом креирања база података сојева, јер Скоро је немогуће објединити снимање резултата приликом извођења анализа у различитим лабораторијама.
Упркос привидној једноставности и брзини извођења (изолација ДНК без доброг пречишћавања, амплификације, визуелизације резултата), ова група метода захтева употребу посебне методе за документовање резултата: дестилацију у полиакриламидном гелу са обележеним (радиоактивним или луминисцентним) прајмери и накнадно осветљење материјала осетљивог на светлост или радиоактивност. Конвенционално снимање етидијум бромид агарозног гела генерално није погодно за ове методе јер може се спојити велики број фрагмената ДНК различитих величина.
Друге методе, напротив, омогућавају генерисање малог броја карактеристика са веома високом поновљивошћу. Ова група укључује проучавање хаплотипова митохондријалне ДНК (у Русији су забележена само два хаплотипа Иа и ИИа), типа парења (већина изолата је подељена на 2 типа: А1 и А2, самооплодни СФ су ретки) и спектра изоензима пептидазе ( два локуса Пеп1 и Пеп2, који се састоје од по два изозима) и глукоза-6-фосфат изомеразе (у Русији нема варијабилности у овој особини, иако је значајан полиморфизам забележен у другим земљама света). Препоручљиво је користити ове карактеристике приликом анализе колекција и састављања база података на регионалном и глобалном нивоу. У случају анализе изоензима и хаплотипова митохондријалне ДНК могуће је и без стандардних сојева, док су у анализи типова парења потребна два тест изолата са познатим типовима парења.
Реакциони услови и реагенси могу утицати само на контраст производа на електроферограму, испољавање артефаката у овим врстама студија није вероватно.
Тренутно, већину популација у европском делу Русије представљају сојеви оба типа парења (табела 6), међу њима има изолата са типовима Иа и ИИа митохондријалне ДНК (други типови мтДНК пронађени у свету нису откривени у Русији после 1993). Спектри изоензима пептидазе су представљени са два генотипа на Пеп1 локусу (100/100, 92/92 и хетерозигота 92/100, при чему је генотип 92/92 изузетно редак (<0,3%)) и два генотипа на Пеп 2 локус (100/100 , 112/112 и хетерозигот 100/112, а генотип 112/112 је ређи од 100/100, али такође прилично чест).
Након 6. године није забележена варијабилност у спектру изоензима глукоза-1993-фосфат (нестанак клонске линије УС-1 има генотип 100/100 (Елански и Смирнов, 2002);
Трећа група метода омогућава добијање довољне групе независних карактеристика маркера са високом репродуктивношћу. Данас ова група укључује узорак РФЛП-РГ57, који производи 25-29 фрагмената ДНК различитих величина. РФЛП-РГ57 се може користити и за анализу узорака и за компајлирање база података. Међутим, овај метод је много скупљи од претходних, захтева доста времена и захтева прилично велику количину високо пречишћене ДНК. Стога је истраживач принуђен да ограничи запремину тестираног материјала.
Развој РФЛП-РГ57 почетком 90-их значајно је интензивирао популацијске студије патогена касне пламењаче. Постао је основа методе засноване на изолацији и анализи „клонских линија“ (види доле). Поред РФЛП-РГ57, тип парења, ДНК отисак прста (РФЛП-РГ57 метода), спектри изоензима пептидазе и глукоза-6-фосфат изомеразе и тип митохондријске ДНК се користе за идентификацију клоналних линија. Захваљујући њему, то су показали сар., 1994), замену старих популација новим (Дрентх ет ал, 1993, Сујковски ет ал, 1994, Гоодвин ет ал, 1995а), а клонске линије преовлађују у многим земљама свет су идентификовани. Истраживања руских сојева овом методом показала су висок генотипски полиморфизам сојева у европском делу и мономорфизам популација у азијским и далекоисточним деловима Русије (Елански ет ал, 2001). И сада овај метод остаје главни у спровођењу популацијских студија П. инфестанс. Међутим, његову широку употребу омета прилично висока цена и радно интензивна имплементација.
Још један обећавајући метод који се не користи широко у истраживању П. инфестанс је анализа микросателитског понављања (ССР). Тренутно се ова метода широко користи за изолацију клонских линија. За анализу сојева, фенотипске маркерске особине као што је присуство гена вируленције за сорте кромпира (Авдеи, 1995, Иваниук ет ал., 2002, Уланова ет ал., 2003) и парадајза су широко коришћене (и настављају да се користе ). До данас, гени вируленције за сорте кромпира изгубили су своју вредност као маркер особина за популационе студије због појаве максималног (или близу њему) броја гена вируленције у огромној већини изолата. Истовремено, ген вируленције Т1 за сорте парадајза које носе одговарајући Пх1 ген се и даље успешно користи као обележје (Лаврова и сар., 2003, Уланова и сар., 2003).
Многе студије користе отпорност на фунгициде као обележје. Ову особину није препоручљиво користити у популацијским студијама због релативно лаке појаве мутација отпорности у клонским линијама након примене фунгицида који садрже металаксил- (или мефеноксам-) на терену. На пример, уочене су значајне разлике у нивоу резистенције унутар клонске лозе Сиб1 (Елански ет ал., 2001).
Дакле, пожељне карактеристике маркера за креирање база података и сојева за обележавање у колекцијама су тип парења, спектар изоензима пептидазе, тип митохондријалне ДНК, РФЛП-РГ57, ССР. За поређење ограничених узорака, ако је потребно користити максималан број карактеристика маркера, можете користити АФЛП, РАПД, ИнтерССР, Интер-СИНЕ ПЦР (табела 5). Међутим, треба имати на уму да су ове методе слабо поновљиве, а у сваком појединачном експерименту (циклус електрофорезе појачања) потребно је користити неколико референтних изолата.
Табела 5. Поређење различитих метода за проучавање сојева П. Инфестанс
Критеријум | ТЦ | Изоензими | МтДНА | РФЛП-РГ57 | РАПД | ИССР | РСБ | АФЛП | рев |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Количина информација | Н | Н | Н | С | В | В | С | В | В |
Репродуцибилност | В | В | В | В | Н | Н | С | С | С |
Могућност артефаката | Н | Н | Н | Н | В | С | Н | С | В |
Коштати | Н | С | Н | В | Н | Н | Н | С | Н |
Интензитет рада | Н | Н | Н | В | НС* | НС* | Н | С | НС* |
Брзина анализе** | В | Н | Н | С | Н | Н | Н | Н | Н |
Напомена: Х – ниско, Ц – средње, В – високо; НС* - низак интензитет рада када се користи агарозни гел или аутоматски
генотип, средњи - када се дестилује у полиакриламидном гелу са обележеним прајмерима,
** - не рачунајући време утрошено на узгој мицелија за изолацију ДНК.
Структура становништва
Клоналне линије
У одсуству рекомбинације или њеног незнатног доприноса структури популације, популацију чини одређени број клонова, међу којима су генетске размене изузетно ретке.
У таквим популацијама информативније је проучавати не фреквенције појединачних гена, већ учесталости генотипова који имају заједничко порекло (клонске лозе) и разликују се само по тачкастим мутацијама. Популационе студије патогена касне пламењаче и анализа клонских линија значајно су убрзане од појаве методе РФЛП-РГ57 почетком 90-их година прошлог века. Поред РФЛП-РГ57, тип парења, спектри изоензима пептидазе и глукоза-6-фосфат изомеразе, и тип митохондријске ДНК се користе за идентификацију клоналних линија. Карактеристике најчешћих клонских линија су дате у табели 6.
Клон УС-1 је доминирао популацијом свуда до касних 80-их, након чега су почели да се замењују другим клоновима и нестали из Европе и Северне Америке. Сада се налази на Далеком истоку (Филипини, Тајван, Кина, Јапан, Кореја, Кох ет ал., 1994, Моса ет ал., 1993), у Африци (Уганда, Кенија, Руанда, Гоодвин ет ал., 1994, Вега-Санцхез ет ал., 2000. Оцхво ет ал., 2002.) иу Јужној Америци (Еквадор, Бразил, Перу, Форбес ет ал., 1997., Гоодвин ет ал., 1994.). Само у Аустралији нису идентификовани сојеви који припадају линији УС-1. Очигледно, изолати П. инфестанс стигли су у Аустралију у другом таласу миграције (Гоодвин, 1997).
Клон УС-6 мигрирао је из северног Мексика у Калифорнију касних 70-их и изазвао епидемију у кромпиру и парадајзу после 32 године одсуства болести. Због своје високе агресивности, заменио је клон УС-1 и постао доминантан на западној обали Сједињених Држава (Гоодвин ет ал., 1995а).
Генотипови УС-7 и УС-8 откривени су у Сједињеним Државама 1992. године и већ су распрострањени у Сједињеним Државама и Канади 1994. године. Током једне пољске сезоне, клон УС-8 је у стању да скоро у потпуности замени клон УС-1 на парцелама кромпира иницијално инфицираних са оба клона у једнаким концентрацијама (Миллер и Јохнсон, 2000).
Клонови БЦ-1 до БЦ-4 идентификовани су у Британској Колумбији у малом броју изолата (Гоодвин ет ал., 1995б). Клон УС-11 се широко проширио у Сједињеним Државама и заменио УС-1 на Тајвану. Клонови ЈП-1 и ЕЦ-1, заједно са клоном УС-1, дистрибуирају се у Јапану и Еквадору, респективно (Кох ет ал., 1994; Форбес ет ал., 1997).
СИБ-1 је клон који је доминирао у Русији на огромној територији од Московске области до Сахалина. Откривен је у московском региону 1993. године, при чему се неке пољске популације претежно састоје од сојева ове клонске линије који су високо отпорни на металаксил. После 1993. године, распрострањеност овог клона је значајно опала. Иза Урала 1997-1998, СИБ-1 је пронађен свуда са изузетком Хабаровске територије (тамо је широко распрострањен клон СИБ-2). Просторно раздвајање клонова који имају различите врсте парења искључује сексуални процес на територији Сибира и Далеког истока. У Московској области, за разлику од Сибира, становништво је представљено многим клоновима; скоро сваки изолат има јединствени мултилокусни генотип (Елански ет ал., 2001, 2015). Ова разноликост се не може објаснити само уношењем сојева гљивица из различитих делова света са увезеним семенским материјалом. Пошто се оба типа парења јављају у популацији, могуће је да је и његова разноврсност последица рекомбинације. Тако се у Британској Колумбији претпоставља настанак генотипова БЦ-2, БЦ-3 и БЦ-4 услед хибридизације клонова БЦ-1 и УС-6 (Гоодвин ет ал., 1995б). Могуће је да се хибридни сојеви такође налазе у московским популацијама. На пример, сојеви МО-4, МО-8 и МО-11 хетерозиготни за ПЕП локус могу бити хибриди између сојева МО-12, МО-21, МО-22, који имају тип парења А2 и хомозиготни су за један алел ПЕП локус и сој МО-8, који има тип парења А1 и хомозигот за други алел локуса. А ако је то тако, а у савременим популацијама П. инфестанс постоји тенденција повећања улоге полног процеса, онда ће се информативна вредност анализе мултилокуса клонова смањити (Елански ет ал., 2001, 2015).
Варијација у клонским линијама
До 90-их година 20. века клонска линија УС-1 била је распрострањена у свету. Већина теренских и регионалних популација састојала се искључиво од сојева са генотипом УС-1. Међутим, уочене су и разлике између изолата, највероватније узроковане процесом мутације. Мутације су се десиле и у нуклеарној и у митохондријској ДНК и утицале су, између осталог, на ниво резистенције на лекове фениламида и на број гена вируленције. Линије које се разликују од оригиналних генотипова по мутацијама означене су додатним бројевима иза тачке иза имена оригиналног генотипа (на пример, УС-1.1 мутантна линија УС-1 клоналне линије). ДНК отисци прстију УС-1.5 и УС-1.6 лоза садрже помоћне лозе различитих величина (Гоодвин ет ал., 1995а, 1995б); клонска лоза УС-6.3 се такође разликује од УС-6 по једној додатној линији (Гоодвин, 1997, Табела 7).
Приликом проучавања митохондријалне ДНК, показало се да је само тип 1б митохондријалне ДНК пронађен у УС-1 клонској линији (Цартер ет ал., 1990). Међутим, при испитивању сојева ове клонске лозе из Перуа и Филипина, уочени су изолати чији се типови митохондријске ДНК разликују од 1б по присуству инсерција и делеција (Гоодвин, 1991, Кох ет ал., 1994).
Табела 6. Мултилокусни генотипови неких клонских линија П. инфестанс
Име | Тип парења | Изоензими | ДНК отисци прстију | МтДНК тип | |
ГПИ | ПЕП | ||||
САД-КСНУМКС | АКСНУМКС | 86/100 | 92/100 | КСНУМКСЕ + КСНУМКС | Ib |
САД-КСНУМКС | АКСНУМКС | 86/100 | 92/100 | КСНУМКСЕ + КСНУМКС | - |
САД-КСНУМКС | АКСНУМКС | 86/100 | 92/100 | КСНУМКСЕ + КСНУМКС | - |
САД-КСНУМКС | АКСНУМКС | 100/100 | 92/92 | КСНУМКСЕ + КСНУМКС | - |
САД-КСНУМКС | A1 | 100/100 | 92/100 | КСНУМКСЕ + КСНУМКС | - |
САД-КСНУМКС | A1 | 100/100 | 92/100 | КСНУМКСЕ + КСНУМКС | ИИб |
САД-КСНУМКС | A2 | 100/111 | 100/100 | КСНУМКСЕ + КСНУМКС | Ia |
САД-КСНУМКС | A2 | 100/111/122 | 100/100 | КСНУМКСЕ + КСНУМКС | Ia |
САД-КСНУМКС | A1 | 100/100 | 83/100 | * | - |
САД-КСНУМКС | A2 | 111/122 | 100/100 | - | - |
САД-КСНУМКС | A1 | 100/111 | 92/100 | КСНУМКСЕ + КСНУМКС | ИИб |
САД-КСНУМКС | A1 | 100/111 | 92/100 | КСНУМКСЕ + КСНУМКС | - |
САД-КСНУМКС | A2 | 100/122 | 100/100 | КСНУМКСЕ + КСНУМКС | - |
САД-КСНУМКС | A2 | 100/100 | 92/100 | КСНУМКСЕ + КСНУМКС | Ia |
САД-КСНУМКС | A1 | 100/111 | 100/100 | КСНУМКСЕ + КСНУМКС | - |
САД-КСНУМКС | A1 | 100/122 | 100/100 | КСНУМКСЕ + КСНУМКС | - |
САД-КСНУМКС | A2 | 100/100 | 92/100 | КСНУМКСЕ + КСНУМКС | Ia |
САД-КСНУМКС | A2 | 100/100 | 92/100 | КСНУМКСЕ + КСНУМКС | Ia |
ЕК-КСНУМКС | A1 | 90/100 | 96/100 | КСНУМКСЕ + КСНУМКС | ИИа |
СИБ-1 | A1 | 100/100 | 100/100 | КСНУМКСЕ + КСНУМКС | ИИа |
СИБ-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | КСНУМКСЕ + КСНУМКС | ИИа |
СИБ-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | КСНУМКСЕ + КСНУМКС | ИИа |
МО-КСНУМКС | A2 | 100/100 | 100/100 | КСНУМКСЕ + КСНУМКС | ИИа |
МО-КСНУМКС | A2 | 100/100 | 100/100 | КСНУМКСЕ + КСНУМКС | Ia |
МО-КСНУМКС | A1 | 100/100 | 100/100 | КСНУМКСЕ + КСНУМКС | ИИа |
МО-КСНУМКС | A1 | 100/100 | 92/100 | КСНУМКСЕ + КСНУМКС | ИИа |
МО-КСНУМКС | A1 | 100/100 | 100/100 | КСНУМКСЕ + КСНУМКС | ИИа |
МО-КСНУМКС | A1 | 100/100 | 100/100 | КСНУМКСЕ + КСНУМКС | Ia |
МО-КСНУМКС | A1 | 100/100 | 92/100 | КСНУМКСЕ + КСНУМКС | ИИа |
МО-КСНУМКС | A1 | 100/100 | 92/92 | КСНУМКСЕ + КСНУМКС | ИИа |
МО-КСНУМКС | A1 | 100/100 | 92/100 | КСНУМКСЕ + КСНУМКС | ИИа |
МО-КСНУМКС | A1 | 100/100 | 100/100 | КСНУМКСЕ + КСНУМКС | Ia |
МО-КСНУМКС | A1 | 100/100 | 92/100 | КСНУМКСЕ + КСНУМКС | Ia |
МО-КСНУМКС | A2 | 100/100 | 100/100 | КСНУМКСЕ + КСНУМКС | Ia |
МО-КСНУМКС | A1 | 100/100 | 100/100 | КСНУМКСЕ + КСНУМКС | Ia |
МО-КСНУМКС | A1 | 100/100 | 100/100 | КСНУМКСЕ + КСНУМКС | Ia |
МО-КСНУМКС | A1 | 100/100 | 100/100 | КСНУМКСЕ + КСНУМКС | Ia |
МО-КСНУМКС | A1 | 100/100 | 100/100 | КСНУМКСЕ + КСНУМКС | ИИа |
МО-КСНУМКС | A1 | 86/100 | 100/100 | КСНУМКСЕ + КСНУМКС | Ib |
МО-КСНУМКС | A1 | 100/100 | 100/100 | КСНУМКСЕ + КСНУМКС | ИИа |
МО-КСНУМКС | A1 | 100/100 | 100/100 | КСНУМКСЕ + КСНУМКС | ИИа |
МО-КСНУМКС | A2 | 100/100 | 100/100 | КСНУМКСЕ + КСНУМКС | ИИа |
МО-КСНУМКС | A2 | 100/100 | 100/100 | КСНУМКСЕ + КСНУМКС | ИИа |
Напомена: * – нема података.
Табела 7. Мултилокусни генотипови и њихове мутантне линије
Име | Тип парења | | ДНК отисци прстију (РГ57) | Белешке | |
ГПИ | ПЕП-1 | ||||
САД-КСНУМКС | АКСНУМКС | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101000110011 | Оригинални генотип 1 |
САД-КСНУМКС | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101011001101000110011 | Мутација у ПЕП |
САД-КСНУМКС | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101010001101000110011 | Мутација у РГ57 |
САД-КСНУМКС | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101001001101000110011 | Мутација у РГ57 |
САД-КСНУМКС | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101010001101000110011 | Мутација у РГ57 и ПЕП |
САД-КСНУМКС | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101010110011 | Мутација у РГ57 |
САД-КСНУМКС | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010110011 | Оригинални генотип 2 |
САД-КСНУМКС | A1 | 100/100 | 92/92 | 1011111001001100010110011 | Мутација у ПЕП |
САД-КСНУМКС | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011101001001100010110011 | Мутација у РГ57 |
САД-КСНУМКС | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001011100010110011 | Мутација у РГ57 |
САД-КСНУМКС | A1 | 100/100 | 100/100 | 1011011001001100010110011 | Мутација у РГ57 и ПЕП |
САД-КСНУМКС | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010010011 | Мутација у РГ57 |
БР-КСНУМКС | A2 | 100/100 | 100/100 | 1011101000001100001111011 | Оригинални генотип 3 |
БР-КСНУМКС | A2 | 100/100 | 100/100 | 1010101000001100001110011 | Мутација у РГ57 |
Постоје и промене у спектрима изоензима. По правилу, настају распадом организма иницијално хетерозиготног за овај ензим на хомозиготне. Године 1993. идентификовали смо сој на плодовима парадајза са карактеристикама карактеристичним за УС-1: РГ57 отисак прста, тип митохондријске ДНК и генотип 86/100 за глукозо-6-фосфат изомеразу, али је био хомозигот (100/100) за прву пептидазу. локус уместо хетерозиготи типични за ову клонску линију су 92/100. Генотип овог соја дали смо назив МО-17 (Табела 6). Мутантне линије УС-1.1 и УС-1.4 се такође разликују од УС-1 по мутацијама у првом пептидазном локусу (Табела 7).
Мутације које доводе до промене у броју гена вируленције код сорти кромпира и парадајза јављају се прилично често. Пријављени су међу изолатима УС-1 клонске лозе у популацијама из Холандије (Дрентх ет ал., 1994), Перуа (Гоодвин ет ал., 1995а), Пољске (Сујковски ет ал., 1991) и северног севера. Америка (Гоодвин ет ал., 1995., 7б). Разлике у броју гена вируленције кромпира такође су примећене међу изолатима клонских линија УС-8 и УС-1995 у Канади и САД (Гоодвин ет ал., 1а), међу изолатима лозе СИБ-2001 у азијском делу. Русије (Елански ет ал., XNUMX).
Изолати са јаким разликама у нивоима резистенције на фениламидне лекове идентификовани су у популацијама моноклонских поља, од којих су сви припадали клонској линији Сиб-1 (Елански ет ал, 2001, Табела 1). Скоро сви сојеви УС-1 клонске лозе су веома осетљиви на металаксил, али су високо резистентни изолати ове лозе изоловани на Филипинима (Кох ет ал., 1994) и Ирској (Гоодвин ет ал., 1996).
Савремене популације П. инфестанс
Централна Америка (Мексико)
Популација П. инфестанс у Мексику се значајно разликује од осталих светских популација, што је првенствено последица њеног историјског положаја. Бројна истраживања ове популације и сродних врста Пхитопхтхора цладе за П. инфестанс, као и локалних врста из рода Соланум, довела су до закључка да се еволуција патогена у централном Мексику одвијала у спрези са еволуцијом биљака домаћина. и био је повезан са сексуалном рекомбинацијом (Грунвалд, Флиер, 2005). Оба типа парења су заступљена у популацији, и то у једнаким размерама, а присуство ооспора у земљишту, на биљкама и кртолама кромпира и дивљих сродних врста Соланума потврђује присуство полног процеса у популацији (Фернандез-Павиа ет ал., 2002). Недавне студије у долини Толука и око ње (сумњиво средиште порекла патогена) потврдиле су висок генетски диверзитет локалне популације П. инфестанс (134 мултилокусна генотипа у узорку од 176 аксесоара) и присуство неколико диференцираних субпопулација у регион (Ванг ет ал., 2017). Фактори који доприносе овој диференцијацији укључују просторно одвајање субпопулација карактеристичних за планинска подручја централног Мексика, разлике у условима узгоја и сортама кромпира који се користе у долинама и планинама, и присуство дивљих врста Соланум са гомољама које могу да делују као алтернативни домаћини. (Фри ет ал., 2009).
Међутим, треба напоменути да су популације П. инфестанс у северном Мексику више клонске природе и сличније северноамеричким популацијама, што може указивати на нове генотипове (Фри ет ал., 2009).
Северна Америка
Северноамеричке популације П. инфестанс су одувек имале веома једноставну структуру и њихов клонски карактер је установљен много пре употребе микросателитске анализе. До 1987. клонска лоза УС-1 доминирала је у Сједињеним Државама и Канади (Гоодвин ет ал., 1995). Средином 70-их, када су фунгициди на бази металаксила постали доступни, овај клон је почео да се замењује другим, отпорнијим генотиповима који су мигрирали из Мексика (Гоодвин ет ал., 1998). До краја 90-их. Генотип УС-8 је у потпуности заменио генотип УС-1 у Сједињеним Државама и постао доминантна клонска линија у кромпиру (Фри ет ал., 2009; Фри ет ал., 2015). Другачија је била ситуација са парадајзом, где је стално било присутно неколико клонских линија, а њихов састав се мењао из године у годину (Фри ет ал., 2009).
Године 2009. у Сједињеним Државама избила је епидемија касне пламењаче на парадајзу великих размера. Посебност ове пандемије била је њена скоро истовремена појава на многим местима у североисточном делу Сједињених Држава, а повезана је са масовном продајом заражених садница парадајза у великим баштенским центрима (Фри ет ал., 2013). Губици усева су били огромни. Микросателитска анализа захваћених узорака открила је да пандемијски сој припада УС-22 клонској линији типа парења А2. У 2009. години удео овог генотипа у америчкој популацији П. инфестанс достигао је 80% (Фри ет ал., 2013). У наредним годинама, удео агресивних генотипова УС-23 (углавном на парадајзу) и УС-24 (на кромпиру) у популацији се стално повећавао, међутим, након 2011. године, учесталост откривања УС-24 се значајно смањила и до данас , око 90% популације патогена у САД представља УС-23 генотип (Фри ет ал., 2015).
У Канади, као и у САД, крајем 90-их. доминантни генотип УС-1 је замењен УС-8, чија је доминантна позиција остала непоколебљива до 2008. У 2009-2010. У Канади су биле озбиљне епидемије касне пламењаче повезане са продајом заражених расада парадајза, али су их изазвали генотипови УС-23 и УС-8 (Калисцхук ет ал., 2012). Приметно је било јасно географско разграничење ових генотипова: УС-23 је био доминантан у западним провинцијама Канаде (68%), док је УС-8 био доминантан у источним провинцијама (83%). У наредним годинама, УС-23 се проширио на источне регионе, али се у целини његов удео у популацији благо смањио због појаве генотипова УС-22 и УС-24 у земљи (Петерс ет ал., 2014). До данас, УС-23 одржава доминантну позицију широм Канаде; УС-8 је присутан у Британској Колумбији, а УС-23 и УС-24 су присутни у Онтарију (Петерс, 2017).
Дакле, северноамеричке популације П. инфестанс представљају првенствено клонске лозе. Током протеклих 40 година, број откривених клонских генотипова достигао је 24. Упркос чињеници да су сојеви оба типа парења присутни у популацији, вероватноћа појаве нових генотипова као резултат сексуалне рекомбинације остаје прилично ниска. Међутим, у последњих 20 година забележено је неколико случајева појаве ефемерних рекомбинантних популација (Гавино ет ал., 2000; Даниес ет ал., 2014; Петерс ет ал., 2014), а у једном случају резултат је укрштање је био генотип УС-11, који је успостављен у Северној Америци дуги низ година (Гавино ет ал., 2000). До 2009. године промене у структури популација биле су повезане са појавом нових, агресивнијих генотипова са њиховом каснијом миграцијом и измештањем претходно доминантних претходника. Десило се 2009-2010 У САД и Канади епифитотије су по први пут показале да се у ери глобализације избијање болести може повезати и са активним ширењем нових генотипова приликом продаје зараженог садног материјала.
Јужна Америка
До недавно, истраживања јужноамеричких популација П. инфестанс нису била ни редовна ни велика. Познато је да је структура ових популација прилично једноставна и укључује 1-5 клонских линија по земљи (Форбес ет ал., 1998). Тако су до 1998. године на кромпиру откривени генотипови УС-1 (Бразил, Чиле), БР-1 (Бразил, Боливија, Уругвај, Парагвај), ЕЦ-1 (Еквадор, Колумбија, Перу и Венецуела), АР-1, АР - 2, АР-3, АР-4 и АР-5 (Аргентина), ПЕ-3 и ПЕ-7 (јужни Перу). Тип парења А2 био је присутан у Бразилу, Боливији и Аргентини и није пронађен изван боливијско-перуанске границе у области језера Титикака, иза којег је генотип А1 типа ЕЦ-1 доминирао у Андима. У парадајзу, УС-1 је остао доминантан генотип широм Јужне Америке.
Ситуација се мање-више наставила и 2000-их. Важна тачка било је откриће нове клонске линије А2 типа ЕЦ-2 на сродницима дивљег кромпира (С. бревифолиум и С. тетрапеталум) у северним Андима (Олива ет ал., 2010). Филогенетска истраживања су показала да ова лоза није потпуно идентична са П. инфестанс, иако је уско сродна са њом, те је стога предложено да се узме у обзир, као и друга линија, ЕЦ-3, изолована из парадајза С. бетацеум дрво које расте у Андима нова врста по имену П. андина; међутим, статус ове врсте (независне врсте или хибрида П. инфестанс са још непознатом лозом) и даље остаје нејасан (Делгадо ет ал., 2013).
Тренутно су све јужноамеричке популације П. инфестанс клонске. Упркос присуству оба типа парења, нису откривене рекомбинантне популације. Генотип УС-1 је свеприсутан на парадајзу, очигледно истиснут из кромпира локалним сојевима, чије тачно порекло још увек није познато. У Бразилу, Боливији и Уругвају присутан је генотип БР-1; у Перуу, поред УС-1 и ЕУ-1, постоји још неколико локалних генотипова. У Андима доминантну позицију задржава клонска лоза ЕЦ-1, чији однос са недавно откривеном П. андином остаје неистражен. Једино „нестабилно“ место где је за период 2003-2013. дошло до значајних популационих промена, Чиле је постао (Ацуна ет ал., 2012), где је 2004-2005. популацију патогена почела је да карактерише отпорност на металаксил и нови хаплотип митохондријалне ДНК (Иа уместо раније присутног Иб). Од 2006. до 2011. године у популацији је доминирао генотип 21 (према ССР), чији је удео достигао 90%, након чега је палма прешла на генотип 20, чија је учесталост у наредне две године остала око 67% (Ацуна, 2015).
Европа
У историји Европе постојала су најмање два таласа миграције П. инфестанс из Северне Америке: у 1. веку. (ХЕРБ-1) и почетком двадесетог века (УС-70). Широка употреба фунгицида који садрже металаксил 1-их година. довело до измештања доминантног генотипа УС-XNUMX и његове замене новим генотиповима. Као резултат тога, у већини западноевропских земаља, популације патогена су биле представљене углавном са неколико клонских линија.
Употреба микросателитске анализе за анализу популација патогена омогућила је да се идентификују озбиљне промене које су се десиле у западној Европи у периоду 2005-2008. Године 2005. откривена је нова клонска линија у Великој Британији, названа 13_А2 (или „Плави 13”) и окарактерисана. по А2 типу парења, висока агресивност и отпорност на фениламиде (Схав ет ал., 2007). Исти генотип је пронађен у узорцима прикупљеним 2004. у Холандији и северној Француској, што указује на миграцију у УК из континенталне Европе, вероватно преко семенског кромпира (Цооке ет ал., 2007). Студија генома представника ове клоналне линије показала је висок степен полиморфизма у њеном низу (до 2016. године број његових субклоналних варијација достигао је 340) и значајан степен варијације у нивоу експресије гена, укљ. ефекторски гени током инфекције биљака (Цооке ет ал., 2012; Цооке, 2017). Ове карактеристике, заједно са продуженим трајањем биотрофне фазе, могу изазвати повећану агресивност 13_А2 и његову способност да нападне чак и сорте кромпира отпорне на касну пламењачу.
Током наредних неколико година, генотип се брзо проширио по земљама северозападне Европе (Велика Британија, Ирска, Француска, Белгија, Холандија, Немачка), док је истовремено истиснуо раније доминантне генотипове 1_А1, 2_А1, 8_А1 (Монтарри ет ал. ., 2010. Гиси и др., 2011.; Према интернет страници ввв.еуроблигхт.нет, удео 2011_А2015 у популацијама наведених земаља достигао је 2017-13% и више; присуство овог генотипа забележено је и у неким земљама источне и јужне Европе. Међутим, 2-60. 80_А2009 је изгубио доминантну позицију у Великој Британији и Француској, уступивши место линији 2012_А13 (у Ирској - 2_А6), а у Холандији и Белгији је делимично замењен генотиповима 1_А8, 1_А1 и 1_А6 (Цооке ет ал., 1; Цооке , 33; Стеллингверф, 2);
До данас, око 70% западноевропске популације П. инфестанс је моноклонско. Према сајту ввв.еуроблигхт.нет, доминантни генотипови у земљама северозападне Европе (Велика Британија, Француска,
Холандија, Белгија) остају, у приближно једнаким размерама, 13_А2 и 6_А1, а овај други се практично не налази ван наведеног региона (са изузетком Ирске), али већ има најмање 58 субклонова (Цооке, 2017). Варијације 13_А2 су у приметном броју присутне у Немачкој, а спорадично се примећују и у земљама средње и јужне Европе. Генотип 1_А1 чини значајан део популација Белгије и делова Холандије и Француске. Генотип 8_А1 се стабилизовао у европској популацији на нивоу од 3-6%, са изузетком Ирске, где је задржао водећу позицију и поделио се на два субклона (Стеллингверф, 2017). Коначно, у 2016. години дошло је до повећања учесталости појављивања нових генотипова 36_А2 и 37_А2, први пут регистрованих 2013-2014; до данас, ови генотипови се налазе у Холандији и Белгији и деловима Француске и Немачке, као иу јужном делу Велике Британије (Цооке, 2017). Приближно 20-30% западноевропске популације годишње представљају јединствени генотипови.
За разлику од Западне Европе, до појаве генотипа 13_А2, популације Северне Европе (Шведска, Норвешка, Данска, Финска) нису биле представљене клонским линијама, већ великим бројем јединствених генотипова (Брурберг ет ал.,
2011). Током периода активног ширења 13_А2 широм Западне Европе, присуство овог генотипа у Скандинавији није забележено све до 2011. године, када је први пут откривен у Северном Јутланду (Данска), где се углавном узгајају индустријске сорте кромпира уз активну употребу металаксила. -садрже фунгициде (Ниелсен ет ал., 2014). Према ввв.еуроблигхт.нет, генотип 13_А2 је такође пронађен у неколико узорака из Норвешке и Данске 2014. и у неколико норвешких узорака 2016. године; Поред тога, 2013. године у Финској је забележено присуство генотипа 6_А1 у малим количинама. Као главни разлог неуспеха 13_А2 и других клонских линија у освајању Скандинавије сматрају се климатске разлике овог региона од земаља западне Европе.
Поред чињенице да прохладна лета и хладне зиме подстичу опстанак ооспора, а не вегетативног мицелијума (Сјохолм ет ал., 2013), замрзавање земљишта зими (које се обично не дешава у топлијим земљама западне Европе) подстиче синхронизацију клијања ооспора и садње кромпира, чиме се јача њихова улога као извора примарне инфекције (Брурберг ет ал., 2011). Такође треба напоменути да је у северним условима развој инфекције из ооспора испред развоја инфекције гомоља, што на крају спречава доминацију још агресивнијих, али касније развијених клонских линија (Иуен, 2012). Структура највише проучаваних популација П. инфестанс у источноевропским земљама (Пољска, балтичке државе) веома је слична оној у Скандинавији.
И овде су присутна оба типа парења и велика већина генотипова утврђених коришћењем ССР анализе је јединствена (Цхмиеларз ет ал., 2014; Рунно-Паурсон ет ал., 2016). Као иу северној Европи, ширење клонских линија (првенствено генотип 13_А2) практично није утицало на локалне популације патогена, које одржавају висок ниво диверзитета уз одсуство изражених доминантних линија.
Присуство 13_А2 се повремено примећује на пољима са комерцијалним сортама кромпира. У Русији је ситуација слична. Микросателитска анализа изолата П. инфестанс прикупљених 2008-2011. у 10 различитих региона европског дела Русије, показао висок степен генотипске разноврсности и потпуни недостатак преклапања са европским клонским линијама (Статсиук ет ал., 2014). Неколико година касније, студија узорака П. инфестанс прикупљених у Лењинградској области 2013-2014. показала је значајне разлике између њих и генотипова из овог региона идентификованих у претходној студији. У обе студије нису пронађени западноевропски генотипови (Бекетова и сар., 2014; Кузњецова и сар., 2016).
Велика генетска разноликост источноевропских популација П. инфестанс и одсуство доминантних клонских линија у њима може бити последица неколико разлога. Прво, као иу северној Европи, климатски услови разматраних земаља доприносе формирању ооспора као примарног извора инфекције (Уланова ет ал., 2010; Цхмиеларз ет ал., 2014). Друго, значајан део производње кромпира у овим земљама се узгаја на малим приватним фармама, често окруженим шумама или другим препрекама за слободно кретање заразног материјала (Цхмиеларз ет ал., 2014). Кромпир узгајан у таквим условима се по правилу практично не третира хемикалијама, а избор сорти се заснива на њиховој отпорности на касну пламењачу, тј. не постоји селективни притисак за агресивност и отпорност на металаксил, што резистентним генотиповима, као што је 13_А2, лишава предности у односу на друге генотипове (Цхмиеларз ет ал., 2014). Коначно, због мале величине земљишних парцела, њихови власници обично не практикују плодоред, већ годинама узгајају кромпир на истом месту, што доприноси акумулацији генетски разноврсног инокулума (Рунно-Паурсон ет ал., 2016; Елански, 2015. Елански и др., 2015.).
Азија
Све до недавно, структура популације П. инфестанс у Азији је остала релативно слабо схваћена. Знало се да је заступљена претежно клонским линијама, а утицај полне рекомбинације на настанак нових генотипова био је веома мали. Тако је, на пример, 1997-1998. у азијском делу Русије (Сибир и Далеки исток) популацију патогена су представљала само три генотипа са доминацијом генотипа СИБ-1 (Елански ет ал., 2001). Присуство клонских линија патогена је показано у земљама као што су Кина, Јапан, Кореја, Филипини и Тајван (Кох ет ал., 1994; Цхен ет ал., 2009). Клонална лоза УС-1 доминирала је на великом подручју Азије у касним 90-им - почетком 2000-их. скоро свуда су почели да се замењују другим генотиповима, који су, заузврат, уступили место новим. У већини случајева промене у структури и саставу популација у азијским земљама биле су повезане са миграцијом нових генотипова споља. Тако у Јапану, са изузетком генотипа ЈП-3, сви остали јапански генотипови који су се појавили након УС-1 (ЈП-1, ЈП-2, ЈП-3) имају мање или више доказано спољашње порекло (Акино ет ал. , 2011) . У Кини тренутно постоје три главне популације патогена, са јасним географским поделама; нема или је веома слаб проток гена између ових популација (Гуо ет ал., 2010; Ли ет ал., 2013б). Генотип 13_А2 појавио се у Кини у њеним јужним провинцијама (Јунан и Сечуан) 2005-2007, и 2012-1014. примећен је и на североистоку земље (Ли ет ал., 2013б). У Индији се 13_А2 појавио вероватно у исто време када и у Кини, највероватније са зараженим семенским кромпиром (Цховдаппа ет ал., 2015), а 2009-2010. изазвао озбиљну појаву касне пламењаче на парадајзу на југу земље, након чега се проширио на кромпир и 2014. године изазвао избијање касне пламењаче у Западном Бенгалу, што је довело до пропасти и самоубиства многих локалних фармера (Фри, 2016).
Африка
До 2008-2010. Није било систематских студија о П. инфестанс у афричким земљама. Тренутно се афричке популације П. инфестанс могу поделити у две групе, а ова подела је јасно повезана са увозом семенског кромпира из Европе.
У Северној Африци, која активно увози семенски кромпир из Европе, тип парења А2 је широко заступљен у скоро свим регионима, што пружа теоретску могућност за настанак нових генотипова као резултат сексуалне рекомбинације (Цорбиере ет ал., 2010; Рекад ет ал., 2017). Поред тога, у Алжиру је примећено присуство генотипова 13_А2, 2_А1 и 23_А1 уз изражену доминацију првог од њих, као и постепено смањење удела јединствених генотипова до потпуног нестанка (Рекад ет ал., 2017) . За разлику од остатка региона, у Тунису (са изузетком североистока земље) популација патогена је претежно представљена типом парења А1 (Харбаоуи ет ал., 2014).
Доминантна клонска линија овде је НА-01. Генерално, удео клонских линија у популацији је само 43%. У источној и јужној Африци, где је увоз семена потпуно мали (Фри ет ал., 2009), П. инфестанс је представљен са само две клонске лозе типа А1, УС-1 и КЕ-1, при чему ова друга активно замењује прву. у кромпиру (Пуле ет ал., 2012; Њороге ет ал., 2016). До данас, оба ова генотипа имају приметну количину субклоналних варијација.
Аустралија
Први извештај о касној пламењачи на кромпиру у Аустралији датира из 1907. године, а прва епифитотија, вероватно изазвана обилним кишама у летњим месецима, догодила се 1909-1911. (Дрентх ет ал., 2002). Уопштено гледано, међутим, каша није од значајног економског значаја за земљу. Спорадична избијања касне пламењаче, изазвана временским условима који обезбеђују високу влажност, јављају се не више од једном у 5-7 година и локализована су углавном у северној Тасманији и централној Викторији. У вези са наведеним, практично не постоје публикације посвећене проучавању структуре аустралијске популације П. инфестанс. Најновије доступне информације су за 1998-2000. (Дрентх ет ал., 2002). Према ауторима, викторијанска популација је била клонска линија УС-1.3, што је индиректно потврдило миграцију овог генотипа из Сједињених Држава. Тасманијски узорци су распоређени у тип АУ-3, различит од генотипова присутних у то време у другим деловима света.
Карактеристике развоја касне болести у Русији
У Европи се примарним инокулумом на кромпиру сматра зараза унесена оболелим семенским кртолима, ооспорама презимљеним у земљишту, као и зооспорангијама донетим ветром са биљака које су израсле из презимљених кртола на прошлогодишњим њивама („добровољне” биљке) , или на гомилама одбачених биљака за складиштење кртола. Од њих најопаснијим извором заразе сматрају се биљке узгајане на гомилама одбачених кртола, јер тамо је број изниклих кртола често значајан, а зооспорангије из њих се могу преносити на велике удаљености. Други извори (ооспоре, „добровољне” биљке) нису толико опасни, јер Није уобичајено узгајати биљке на истим њивама више од једном у 3-4 године. Инфекција од оболелих семенских кртола је такође минимална због доброг система контроле квалитета семена.
Уопштено говорећи, количина инокулума у европским популацијама је ограничена, па је због тога раст епидемије прилично спор и може се успешно контролисати уз помоћ хемијских фунгицидних лекова. Главни задатак у европским условима је сузбијање инфекције у фази када почиње масовно ширење зооспорангија са оболелих биљака.
У Русији је ситуација радикално другачија. Већина усева кромпира и парадајза се узгаја у малим приватним баштама; заштитне мере се на њима или уопште не спроводе, или се фунгицидни третмани спроводе у недовољним количинама и почињу након појаве касне пламењаче на врховима. Као резултат тога, приватни вртови делују као главни извор заразе из њих ветар преноси у комерцијалне засаде. То потврђују наша директна запажања у областима Москве, Брјанска, Кострома и Рјазања: оштећења биљака у приватним баштама примећују се и пре почетка третирања комерцијалних засада фунгицидима. Потом се епидемија на великим пољима контролише употребом фунгицидних лекова, док у приватним баштама долази до наглог развоја касне пламењаче.
У случају нетачних или „буџетних“ третмана комерцијалних засада, на пољима се појављују жаришта касне пламењаче; у будућности се активно развијају, захватајући све веће површине (Елански, 2015). Инфекције које се развијају у приватним баштама имају значајан утицај на епидемије у комерцијалним областима. У свим регионима за узгој кромпира у Русији, површина коју заузима кромпир у приватним баштама је неколико пута већа од укупне површине поља великих произвођача. У таквим условима, приватне баште са поврћем могу се сматрати глобалним ресурсом инокулума за комерцијална поља. Покушајмо да идентификујемо оне особине које су карактеристичне за генотипове сојева у приватним баштама.
Садња сточног кромпира који није прошао семенску и карантинску контролу, семена парадајза добијеног од сумњивих страних произвођача, дуготрајно гајење кромпира и парадајза на истим површинама, неправилан третман фунгицидима или њихово потпуно одсуство доводе до озбиљних епифитозија у приватном сектору, што резултира слободним укрштањем, хибридизацијом и формирањем ооспора у приватним баштама. Као резултат тога, примећује се веома висока генотипска разноликост патогена, када је скоро сваки сој јединствен у свом генотипу (Елански ет ал., 2001, 2015). Садња семенског кромпира различитог генетског порекла чини мало вероватним да ће се појавити клонске линије специјализоване за напад на одређену сорту. Одабрани сојеви у овом случају одликују се својом свестраношћу у односу на захваћене сорте, већина њих има близу максималног броја гена вируленције. Ово се веома разликује од система „клонских линија“ типичних за велика поља пољопривредних организација са правилно инсталираним системом заштите од касне пламењаче. „Клонске линије“ (када су сви сојеви патогена касне пламењаче на терену заступљени са једним или више генотипова) су свеприсутне у земљама у којима се узгој кромпира баве искључиво великим фармама: САД, Холандија, Данска итд. Енглеској, Ирској, Пољској, где је узгајање кромпира традиционално уобичајено, постоји и већи генотипски диверзитет у приватним баштама. „Клонске линије“ крајем 20. века биле су распрострањене у азијским и далекоисточним деловима Русије (Елански ет ал., 2001), што је, очигледно, последица употребе истих сорти за садњу искључиво домаће производње. кромпира. У последње време ситуација у овим регионима је такође почела да се мења у правцу повећања генотипске разноврсности популација.
Одсуство интензивних третмана фунгицидним препаратима има још једну, директну последицу – нема гомилања резистентних сојева у баштама. Заиста, наши резултати показују да се сојеви отпорни на металаксил значајно ређе идентификују у приватним баштама него у комерцијалним засадима.
Непосредна близина засада кромпира и парадајза, типична за приватне баште, олакшава миграцију сојева између ових усева, услед чега је, у последњој деценији, међу сојевима изолованим из кромпира, удео сојева који носе ген отпорности на сорте чери парадајза (Т1), раније карактеристичне само за “ сојеве парадајза. Сојеви са Т1 геном се у већини случајева испостављају веома агресивним и према кромпиру и према парадајзу.
Последњих година касна пламењача на парадајзу је почела да се јавља у многим случајевима раније него на кромпиру. Извор инфекције расада парадајза могу бити ооспоре у земљишту или ооспоре присутне у семену парадајза или прилепљене на њега (Рубин ет ал., 2001). Током протеклих 15 година у продавницама се појавио велики број јефтиног упакованог семена, углавном из увоза, а већина малих произвођача је прешла на њихову употребу. Семе може да садржи сојеве са генотиповима типичним за регионе у којима се узгаја. Након тога, ови генотипови се укључују у сексуални процес у приватним баштама, што доводи до појаве потпуно нових генотипова.
Тако се може констатовати да су приватне баште глобални „лонац за топљење” у коме се, као резултат размене генетског материјала, обрађују постојећи генотипови и појављују потпуно нови. Истовремено, њихова селекција се одвија у условима који се веома разликују од оних створених за кромпир на великим фармама: одсуство фунгицидне пресе, сортна униформност засада, преовлађивање биљака погођених различитим облицима вирусне и бактеријске инфекције, близина парадајза и дивљег велебиља, активно укрштање и формирање ооспора, могућност да ооспоре делују као извор заразе за следећу годину.
Све ово доводи до веома високог генотипског диверзитета популација газдинстава. У епифитотским условима, касна пламењача се веома брзо шири у повртњацима и ослобађају се огромне количине спора које лете у оближње комерцијалне засаде. Међутим, када се нађу на комерцијалним њивама са правилним системом агротехнике и хемијске заштите, пристигле споре практично немају могућност да иницирају епифитотију на терену, што је последица недостатка клонских линија отпорних на фунгициде специјализованих за култивисану сорту.
Други извор примарног инокулума могу бити оболеле кртоле које се уносе у комерцијалне засаде са семенским материјалом. Ове кртоле су гајене, по правилу, на пољима са добром пољопривредном технологијом и интензивном хемијском заштитом. Генотипови изолата који су захватили кртоле прилагођени су развоју на њиховој сорти. Ови сојеви су много опаснији за комерцијалне засаде од инокулума који потиче из приватних башта. У прилог овој претпоставци иду и резултати нашег истраживања. Популације изоловане са великих ораница са правилно спроведеном хемијском заштитом и добром пољопривредном технологијом не одликују се високим генотипским диверзитетом. Често је то неколико клонских линија које су веома агресивне.
Сојеви комерцијалног семенског материјала могу ући у популације у повртњацима и бити укључени у процесе који се у њима одвијају. Међутим, у повртњаку ће њихова конкурентност бити много нижа него на комерцијалном пољу и ускоро ће престати да постоје у облику клонске линије, али њихови гени могу да се користе у популацији „баште“.
Инфекција која се развија на „добровољним” биљкама и на гомилама кртола одбачених током бербе није толико релевантна за Русију, јер У главним регионима за узгој кромпира Русије примећује се дубоко зимско замрзавање тла, а биљке из гомоља које су презимиле у тлу се ретко развијају. Штавише, као што показују наши експерименти, патоген касне мрље не преживи на температурама испод нуле чак ни на кртолама који остају одрживи. У аридној зони, где се практикује рани узгој кромпира, касна пламењача је прилично ретка због сушне и вруће вегетације.
Дакле, тренутно уочавамо поделу популација П. инфестанс на популације „пољске“ и „баштенске“. Међутим, последњих година примећени су процеси који су довели до конвергенције и међусобног продирања генотипова из ових популација.
Међу њима се може уочити општи пораст писмености малих произвођача, појава приступачних малих паковања семенског кромпира, ширење фунгицидних препарата у малим паковањима и губитак страха од „хемије“ становништва.
Ситуације настају када се, захваљујући активном раду једног добављача, читава села нађу засађена семенским кртолама исте сорте и снабдевена малим паковањима истих пестицида. Сасвим је могуће претпоставити да ће се кромпир исте сорте појавити и на комерцијалним засадима у близини.
С друге стране, неке компаније које продају пестициде промовишу „јефтине“ шеме хемијског третмана. У овом случају се потцењује број препоручених третмана и нуде најјефтинији фунгициди, а акценат није на спречавању развоја пламењаче до кошења врхова, већ на одређеном одлагању епифитотије у циљу повећања принос. Такве шеме су економски оправдане када се узгајају прехрамбени кромпир од семенског материјала ниског квалитета, када у принципу нема говора о добијању високог приноса. Међутим, у овом случају, за разлику од баштенских популација, изједначена генетска позадина кромпира доприноси одабиру специфичних физиолошких раса, које су веома опасне за дату сорту.
Генерално, трендови ка конвергенцији „баштенског“ и „пољског“ начина производње кромпира нам се чине прилично опасним. Да би се спречиле њихове негативне последице како у домаћинству тако и у привреди, биће потребно како контролисати асортиман семенског кромпира и асортиман фунгицида који се нуде приватним трговцима у малој амбалажи, тако и пратити шеме заштите кромпира и употребу фунгицидних препарата у комерцијални сектор.
У областима приватног сектора интензивно се развија не само касна болест, већ и Алтернариа. Већина власника приватних парцела не предузимају посебне мере за заштиту од Алтернарије, погрешно развијајући Алтернарију за природно увенуће врхова или развој касне болести. Стога, са масовним развојем Алтернарије на осетљивим сортама, парцеле за домаћинство могу послужити као извор инокулума за комерцијалне засаде.
Механизми варијабилности
Процес мутације
Пошто је појава мутација случајан процес који се јавља са малом фреквенцијом, појава мутација на било ком локусу зависи од учесталости мутације овог локуса и величине популације. Приликом проучавања учесталости мутација сојева П. инфестанс, обично се утврђује број колонија узгојених на селективним хранљивим подлогама након третмана хемијским или физичким мутагенима. Као што се може видети из података приказаних у табели 8, учесталост мутације истог соја на различитим локусима може се разликовати за неколико редова величине. Висока учесталост мутација отпорности на металаксил може бити један од разлога акумулације сојева отпорних на њега у природи.
Учесталост спонтаних или индукованих мутација, израчуната на основу лабораторијских експеримената, не одговара увек процесима који се дешавају у природним популацијама из следећих разлога:
1. Код асинхроних нуклеарних подела немогуће је проценити учесталост мутација по нуклеарној генерацији. Због тога, већина експеримената пружа информације само директно о учесталости мутација, без разликовања између два мутација и једног догађаја након митозе.
2. Једностепене мутације обично смањују равнотежу генома, па се упоредо са стицањем новог својства смањује и укупна кондиција организма. Већина експериментално добијених мутација има смањену агресивност и нису забележене у природним популацијама. Тако је коефицијент корелације између степена отпорности мутаната П. инфестанс на фениламидне фунгициде и брзине раста на вештачкој подлози био у просеку (–0,62), а отпорности на фунгициде и агресивности на листовима кромпира (–0,65) (Деревиагина ет. ал., 1993), што указује на ниску способност мутаната. Мутације резистенције на диметоморф су такође биле праћене наглим смањењем виталности (Багирова и сар., 2001).
3. Већина спонтаних и индукованих мутација је рецесивна и не манифестује се фенотипски у експериментима, али чине скривену резерву варијабилности у природним популацијама. Мутантни сојеви изоловани у лабораторијским експериментима носе доминантне или полу-доминантне мутације (Кулисх и Диаков, 1979). Очигледно, диплоидност језгара објашњава неуспешне покушаје добијања мутаната под утицајем УВ зрачења који су били вирулентни на претходно отпорним сортама (МцКее, 1969). Према прорачунима аутора, такве мутације се могу јавити са учесталошћу мањом од 1:500000. Прелазак рецесивних мутација у хомозиготно, фенотипски изражено стање може се десити услед сексуалне или асексуалне рекомбинације (види доле). Међутим, чак иу овом случају, мутација може бити маскирана доминантним алелима језгара дивљег типа у коенотском (вишејезгарном) мицелијуму и бити фенотипски фиксирана само током формирања мононуклеарних зооспора.
Табела 8. Учесталост мутација П. инфестанс на супстанце које инхибирају раст под утицајем нитрозометилурее (Долгова, Диаков, 1986; Багирова ет ал., 2001)
Прикључак | Фреквенција мутације |
Окитетрацицлине | КСНУМКС КСНУМКС х-8 |
Бластицидин С | КСНУМКС КСНУМКС х-8 |
Стрептомицин | КСНУМКС кКСНУМКС-8 |
Трицхотхецин | КСНУМКС КСНУМКС х-8 |
Цицлохекимиде | КСНУМКС КСНУМКС х-8 |
Дацонил | < 4 к 10-8 |
Диметхоморф | КСНУМКС КСНУМКС х-7 |
Металакил | КСНУМКС КСНУМКС х-6 |
Величине популације такође играју одлучујућу улогу у настанку спонтаних мутација. У веома великим популацијама, у којима је број ћелија Н>1/а, где је а стопа мутације, мутација престаје да буде случајна појава (Квитко, 1974).
Прорачуни показују да се при просечној заражености поља кромпира (35 пега на једној биљци) дневно формира 8к1012 спора на једном хектару (Диаков, Супрун, 1984). Очигледно, у таквим популацијама све мутације дозвољене типом размене се јављају на сваком локусу. Чак и ретку мутацију која се јавља са фреквенцијом од 10-9 стећи ће хиљаду јединки од милиона који живе на једном хектару поља кромпира. За мутације које се јављају на вишој фреквенцији (на пример, 10-6), разне парне мутације (на два локуса истовремено) могу се јавити свакодневно у таквој популацији, тј. процес мутације ће заменити рекомбинацију.
Миграције
За П. инфестанс су позната два главна типа миграције: на кратке удаљености (унутар поља кромпира или суседних поља) распршивањем зооспорангија ваздушним струјама или прскањем кише и на велике удаљености – садњом кртола или транспортованим плодовима парадајза. Први метод обезбеђује ширење фокуса болести, други - стварање нових жаришта на местима удаљеним од примарног.
Ширење заразе кртолама и плодовима парадајза не само да доприноси појави болести на новим местима, већ је и главни извор генетске разноврсности популација. У Подмосковљу се узгаја кромпир донет из различитих региона Русије и Западне Европе. Плодови парадајза се доносе из јужних региона Русије (Астраханска област, Краснодарски крај, Северни Кавказ). Семе парадајза, које може послужити и као извор заразе (Рубин ет ал., 2001), увози се и из јужних региона Русије, Кине, европских земаља и других земаља.
Према прорачунима Е. Маир (1974), генетске промене у локалној популацији изазване мутацијама ретко прелазе 10-5 по локусу, док у отвореним популацијама размена због контра тока гена није мања од 10-3 - 10-4 .
Миграција у зараженим кртолама је одговорна за улазак П. инфестанс у Европу и његово ширење по свим регионима света у којима се узгаја кромпир; изазивају најозбиљније промене становништва. На територији Руске империје појавила се каша на кромпиру скоро истовремено са појавом у западној Европи.
Пошто је болест први пут забележена 1846-1847 у балтичким државама и тек у наредним годинама се проширила на Белорусију и северозападне регионе Русије, њено западноевропско порекло је очигледно. Први извор касне мрље у Старом свету није тако очигледан. Хипотеза коју су развили Фри ет ал., 1992, Фри, Гоодвин, 1995, Гоодвин ет ал., 1994 сугерише да је паразит дошао из Мексика прво у Северну Америку, где се проширио кроз усеве, а затим је пренет у Западну Европу (Слика; 7).
Као резултат поновљеног дрифта (ефекат двоструког уског грла), појединачни клонови су ушли у Европу, чији су потомци изазвали пандемију на целој територији Старог света, где се узгаја кромпир. Као доказ за ову хипотезу, аутори наводе, прво, распрострањену појаву само једног типа парења (А1) и, друго, хомогеност генотипова проучаваних сојева из различитих региона (свих према молекуларним маркерима, укључујући 2 локуси изоензима, узорци ДНК отисака прстију и структура митохондријалне ДНК је идентична и одговара УС-1 клону описаном у САД). Међутим, неки подаци доводе у сумњу бар неке одредбе наведене хипотезе. Анализа митохондријалне ДНК П. инфестанс, изоловане из хербарских узорака кромпира зараженог током прве епифитоте 40-их година 1. века, показала је да се по структури митохондријалне ДНК разликују од клона УС-2001, који је, дакле, био на барем не једини извор инфекције у Европи (Ристаино ет ал, XNUMX).
Ситуација са касном палежом поново се погоршала 80-их. Дошло је до следећих промена:
1) Повећана је просечна агресивност становништва, што је довело, посебно, до широког ширења најштетнијег облика касне пламењаче - оштећења петељки и стабљика.
2) Дошло је до померања времена појаве касне пламењаче на кромпиру – од краја јула до почетка јула, па чак и до краја јуна.
3) Тип парења А2, који је раније био одсутан у Старом свету, почео је да се налази свуда.
Променама су претходила два догађаја: широка употреба новог фунгицида металаксил (Сцхвинн и Стауб, 1980) и појава Мексика као светског извозника кромпира (Ниедерхаусер, 1993). У складу са тим, наведена су два разлога за промене популације: конверзија типа парења под утицајем металаксила (Ко, 1994) и масовно увођење нових сојева са зараженим кртолама из Мексика (Фри и Гоодвин, 1995). Иако су интерконверзије типова парења под утицајем металаксила добијене не само код Ко, већ иу раду спроведеном у лабораторији Московског државног универзитета (Савенкова, Цххерепенницова-Аникина, 2002), друга хипотеза је пожељнија. Упоредо са појавом другог типа парења, дошло је до озбиљних промена у генотиповима руских сојева П. инфестанс, укључујући неутралне гени (изоензим и РФЛП локуси), као иу структури митохондријалне ДНК. Комплекс ових промена се не може објаснити дејством металаксила, већ је дошло до масовног увоза нових сојева из Мексика, који су, будући да су агресивнији (Като ет ал., 1997), заменили старе сојеве (УС-1); , постајући доминантни у популацији. До промене у саставу европских популација дошло је у веома кратком временском периоду – од 1980. до 1985. године (Фри ет ал., 1992). На територији бившег СССР-а „нови сојеви” су откривени у колекцијама из Естоније 1985. године, односно раније него у Пољској и Немачкој (Гоодвин ет ал., 1994). Последњи пут када је „стари сој УС-1“ у Русији изолован из зараженог парадајза у Московској области, био је 1993. године (Долгова ет ал., 1997). Такође у Француској, „стари“ сојеви су пронађени у засадима парадајза до раних 90-их, односно након што су одавно нестали из кромпира (Лебертон, Андривон, 1998). Промене сојева П. инфестанс утицале су на многе карактеристике, укључујући и оне од значајног практичног значаја, и повећале штетност касне пламењаче.
Сексуална рекомбинација
Да би сексуална рекомбинација допринела варијабилности, неопходно је, прво, присуство два типа парења у популацији у односу близу 1:1, и, друго, присуство почетне варијабилности у популацији.
Однос типова парења веома варира у различитим популацијама, па чак и у различитим годинама у истој популацији (Табеле 9,10, 90). Разлози за тако драматичне промене у учесталости типова парења у популацијама (као, на пример, у Русији или Израелу почетком 2002-их година прошлог века) су непознати, али се верује да је то због увођења конкурентнијих клонови (Цохен, XNUMX).
Неки индиректни подаци указују на појаву полног процеса у појединим годинама и појединим регионима:
1) Студије популација из Московског региона показале су да је у 13 популација у којима је удео типа парења А2 био мањи од 10%, укупна генетска разноврсност израчуната из три локуса изоензима износила је 0,08, а у 14 популација у којима је удео А2 је премашио 30%, генетски диверзитет је био двоструко већи (0,15) (Елански ет ал., 1999). Дакле, што је већа вероватноћа полног односа, већа је и генетска разноликост популације.
2) Веза између односа типова парења у популацијама и интензитета формирања ооспора уочена је у Израелу (Цохен ет ал., 1997) и у Холандији.
(Флиер ет ал., 2004). Наше студије су показале да су у популацијама у којима су изолати са типом парења А2 чинили 62, 17, 9 и 6%, ооспоре пронађене у 78, 50, 30 и 15% анализираних листова кромпира (са 2 или више пега), редом.
Узорци са 2 или више пега су значајно чешће садржали ооспоре него узорци са 1 пегом (32 односно 14% узорака) (Априсхко ет ал., 2004).
Ооспоре су биле значајно чешће у листовима средњег и доњег слоја биљака кромпира (Митса ет ал., 2015; Елански ет ал., 2016).
3) У неким регионима откривени су јединствени генотипови, чија се појава повезује са сексуалном рекомбинацијом. Тако су у Пољској 1989. и Француској 1990. откривени сојеви хомозиготни за локус глукозе-6.
фосфатна изомераза (ГПИ 90/90). Пошто је раније било само 10/90 хетерозигота у току 100 година, хомозиготност се приписује сексуалној рекомбинацији (Сујковски ет ал., 1994). У Колумбији (САД) уобичајени су изолати који комбинују А2 са ГПИ 100/110 и А1 са ГПИ 100/100, али на крају сезоне 1994. (16. август и 9. септембар) сојеви са рекомбинантним генотиповима (А1 ГПИ 100/110 ) откривени су и А2 ГПИ 100/100) (Миллер ет ал., 1997).
4) У неким популацијама из Пољске (Сујковски ет ал., 1994) и Северног Кавказа (Аматкханова ет ал., 2004), дистрибуција локуса ДНК отиска прста и локуса протеина алозима одговара Харди-Веинберг расподели, што указује на
о високом доприносу полне рекомбинације варијабилности популација. У другим регионима Русије није пронађена кореспонденција са Харди-Вајнберговом дистрибуцијом у популацијама, али је показано присуство неравнотеже веза, што указује на преовлађивање клонске репродукције (Елански ет ал., 1999).
5) Генетски диверзитет (ГСТ) између сојева са различитим типовима парења (А1 и А2) био је мањи него између различитих популација (Сујковски ет ал., 1994), што индиректно указује на сексуална укрштања.
Истовремено, допринос сексуалне рекомбинације популацијској разноликости не може бити веома висок. Овај допринос је израчунат за популације московског региона (Елански ет ал., 1999). Према прорачунима Левонтина (1979), „рекомбинација, која може произвести нове варијанте из два локуса са фреквенцијом која не прелази производ њихових хетерозиготности, постаје ефикасна само ако су вредности хетерозиготности за оба алела већ високе.
Уз уобичајени однос два типа парења за московску област 4:1, фреквенција рекомбинације ће бити 0,25. Вероватноћа да ће укрштени сојеви бити хетерозиготни за два од три проучавана локуса изоензима у испитиваним популацијама била је 0,01 (2 соја од 177). Сходно томе, вероватноћа појаве двоструких хетерозигота као резултат рекомбинације не би требало да пређе њихов производ помножен са вероватноћом укрштања (0,25к0,02к0,02) = 10-4, тј. Сексуални рекомбинанти обично нису укључени у проучавани узорак сојева. Ови прорачуни су направљени за популације из Московског региона, које карактерише релативно велика варијабилност. У мономорфним популацијама попут сибирских, сексуални процес, чак и ако се јавља у појединачним популацијама, не може утицати на њихову генетску разноликост.
Поред тога, П. инфестанс карактерише честа кршења сегрегације хромозома у мејози, што доводи до анеуплоидије (Цартер ет ал., 1999). Овакви поремећаји смањују плодност хибрида.
Парасексуална рекомбинација, митотичка конверзија гена
У експериментима на фузији сојева П. инфестанс са мутацијама отпорности на различите инхибиторе раста, откривена је појава изолата отпорних на оба инхибитора (Схаттоцк, Схав, 1975; Диаков, Кузовникова, 1974; Кулисх, Диаков,
1979). Сојеви отпорни на два инхибитора раста настали су као резултат хетерокариотизације мицелијума, иу овом случају су се током репродукције цепали мононуклеарним зооспорама (Јуделсон, Ге Ианг, 1998), или нису били подељени у потомству монозооспора, јер су имали тетраплоид (од оригинални изолати су диплоидна) језгра (Кулисх, Диаков, 1979). Хетерозиготни диплоиди су се сегрегирали на веома ниској фреквенцији због хаплоидизације, недисјункције хромозома и митотичког прелаза (Поединок ет ал., 1982). Учесталост ових процеса може се повећати одређеним ефектима на хетерозиготне диплоиде (на пример, УВ зрачење клијавих спора).
Иако се формирање вегетативних хибрида са двоструком отпорношћу дешава не само ин витро, већ и у кртолама кромпира зараженим мешавином мутаната (Кулисх ет ал., 1978), прилично је тешко проценити улогу парасексуалне рекомбинације у стварању нови генотипови у популацијама. Учесталост формирања сегреганата услед хаплоидизације, недисјункције хромозома и митотичког укрштања без посебних утицаја је занемарљива (мања од 10-3).
Појава хомозиготних сегреганата хетерозиготних сојева може се заснивати и на митотичком укрштању и митотичкој конверзији гена, која се код П. сојае јавља са фреквенцијом од 3 к 10-2 до 5 к 10-5 по локусу, у зависности од соја ( Цхамнанпунт ет ал., 2001).
Иако се испоставило да је учесталост појаве хетерокариона и хетерозиготних диплоида неочекивано висока (достиже десетине процената), овај процес се дешава само када се стапају мутантне културе добијене из истог соја. Када се користе различити сојеви изоловани из природе, хетерокариотизација се не јавља (или се јавља са веома малом учесталошћу) због присуства вегетативне некомпатибилности (Поединок, Диаков, 1981; Аникина ет ал., 1997б; Цхерепенникова-Аникина ет ал., 2002). ). Сходно томе, улога парасексуалне рекомбинације се може свести само на интраклоналну рекомбинацију у хетерозиготним једрима и прелазак појединачних гена у хомозиготно стање без сексуалног процеса. Овај процес може бити од епидемиолошког значаја код сојева који имају рецесивну или полу-доминантну мутацију отпорности на фунгицид. Његов прелазак у хомозиготно стање као резултат парасексуалног процеса повећаће отпорност носиоца мутације (Долгова, Диаков, 1986).
Интрогресија гена
Хетероталичне врсте Пхитопхтхора су способне да се укрштају и формирају хибридне ооспоре (видети Воробиова и Гриднев, 1983; Сансоме ет ал., 1991; Велд ет ал., 1998). Природни хибрид две врсте Пхитопхтхора био је толико агресиван да је уништио хиљаде јоха у Великој Британији (Брасиер ет ал., 1999). П. инфестанс се може јавити са другим врстама из рода (П. еритхросептица, П. ницотианае, П. Цацторум, итд.) на уобичајеним биљкама домаћинима иу земљишту, али у литератури има мало података о могућности појаве интерспецифичних хибрида. . Хибриди између П. инфестанс и П. Мирабилис добијени су у лабораторијским условима (Гоодвин и Фри, 1994).
Табела 9. Удео сојева П. инфестанс са типом парења А2 у различитим земљама света у периоду од 1990. до 2000. године (према отвореним литературним изворима и сајтовима ввв.еуроблигхт.нет, ввв.еуцаблигхт.орг)
Земља | 1990 | 1991 | 1992 | 1993 | 1994 | 1995 | 1996 | 1997 | 1998 | 1999 | 2000 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Белорусија | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | |||||||||
Белгија | КСНУМКС (КСНУМКС *) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | ||||||||
Еквадор | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | |
Естонија | КСНУМКС (КСНУМКС) | ||||||||||
Англия | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | ||||||||
Финска | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | ||||
Француска | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) |
Мађарска | КСНУМКС (КСНУМКС) | ||||||||||
Ирска | КСНУМКС (КСНУМКС) | ||||||||||
Север Ирска | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | |||
Холандија | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | ||||||
Норвешка | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | ||||||
Перу | 0(34, 1984 -86) | 0(287, 1997-98) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | |||||||
Пољска | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | ||||||
Шотландия | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | |||||||
Шведска | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | ||||||||
Велс | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | |||||||
Кореа | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | ||||||||
Кина | 20(142, 1995-98) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | |||||||
Колумбија | 0(40, 1994-2000) | ||||||||||
Уругвај | 100(25, 1998-99) | ||||||||||
Мароко | 60(108, 1997-2000) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | ||||||||
Сербия | КСНУМКС (КСНУМКС) | ||||||||||
Мексико (Толуца) | 28(292, 1988-89) | 50(389, 1997-98) |
Табела 10. Удео сојева П. инфестанс са А2 типом парења у различитим земљама света од 2000. до 2011. године.
Земља | 2001 | 2002 | 2003 | 2004 | 2005 | 2006 | 2007 | 2008 | 2009 | 2010 | 2011 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Аустрија | КСНУМКС (КСНУМКС) | ||||||||||
Белорусија | КСНУМКС (КСНУМКС) | ||||||||||
Белгија | КСНУМКС (КСНУМКС *) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) |
Швајцарска | КСНУМКС (КСНУМКС) | ||||||||||
Чехия | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | |||||||
Немачка | КСНУМКС (КСНУМКС) | ||||||||||
Данска | КСНУМКС (КСНУМКС) | ||||||||||
Еквадор | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | ||||
Естонија | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | |||||
Англия | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | ||||
Финска | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | 42 | ||||||||
Француска | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | ||
Мађарска | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | 9 | 7 | |||||||
Север Ирска | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) |
Холандија | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | ||||||||
Норвешка | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | ||||||||
Перу | КСНУМКС (КСНУМКС) | ||||||||||
Пољска | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | ||
Шотландия | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | |||||
Шведска | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | |||||||||
Словачка | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | |||||||
Велс | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | ||||||
Кореа | КСНУМКС (КСНУМКС) | ||||||||||
Бразил | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | |||||||||
Кина | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | КСНУМКС (КСНУМКС) | ||||||||
Вијетнам | 0(294, 2003-04) | ||||||||||
Уганда | КСНУМКС (КСНУМКС) |
Динамика генотипског састава популација
Промене у генотипском саставу популација П. инфестанс могу настати под утицајем миграције нових клонова из других региона, пољопривредне праксе (промена сорти, употреба фунгицида) и временских услова. Спољни утицаји различито утичу на клонове у различитим фазама животног циклуса, стога, популације подлежу годишњим цикличним променама у учесталости гена који су подложни селекцији, услед промене преовлађујуће улоге генетског дрифта и селекције.
Ефекат сорте
Нове сорте са ефективним генима вертикалне резистенције (Р-гени) су моћан селективни фактор који селектује клонове са комплементарним генима вируленције у популацијама П. инфестанс. Уколико сорта кромпира нема неспецифичну резистенцију која инхибира раст популације патогена, процес промене доминантних клонова у популацији се одвија веома брзо. Тако је након ширења сорте Домодедово, која има ген отпорности Р3, у Подмосковљу, учесталост клонова вирулентних за ову сорту порасла са 0,2 на 0,82 у једној години (Диаков, Деревјагина, 2000).
Међутим, промене у учесталости гена вируленције (патотипова) у популацијама настају не само под утицајем култивисаних сорти кромпира. На пример, у Белорусији су до 1977. године доминирали клонови са генима вируленције 1 и 4, што је узроковано гајењем сорти кромпира са генима отпорности Р1 и Р4 (Дорозхкин и Белскаиа, 1979). Међутим, крајем 70-их година двадесетог века појављују се клонови са различитим генима вируленције и њиховим комбинацијама, а њихови комплементарни гени отпорности никада нису коришћени у оплемењивању кромпира (гени екстра вируленције) (Иваниук ет ал., 2002). Разлог за појаву оваквих клонова је очигледно миграција инфективног материјала из Мексика са кртолама кромпира у Европу. Код куће, ови клонови су се развили не само на култивисаном кромпиру, већ и на дивљим врстама које носе различите гене отпорности, па је комбинација многих гена вируленције у геному била неопходна за опстанак у тим условима.
Што се тиче сорти са неспецифичном отпорношћу, оне, смањујући стопу репродукције патогена, одлажу еволуцију његових популација, што је, као што је већ поменуто, функција броја. Пошто је агресивност полигена, клонови који садрже већи број гена „агресије“ акумулирају се брже што је већа величина популације. Дакле, високоагресивне расе нису производ адаптације на култивисане сорте са неспецифичном отпорношћу, већ се, напротив, детектују у засадима високо осетљивих сорти, које су акумулатори спора паразита.
Тако су у Русији најагресивније популације П. инфестанс пронађене у зонама годишњих епифитотија (популације из области Сахалина, Лењинграда, Брјанска). Показало се да је агресивност ових популација већа од мексичке (Филиппов ет ал., 2004).
Поред тога, у листовима отпорних сорти формира се мање ооспора него код осетљивих (Хансон и Схаттоцк, 1998), односно неспецифична отпорност сорте смањује и рекомбинационе способности паразита и могућност алтернативних метода зимовања.
Ефекат фунгицида
Фунгициди не само да смањују број фитопатогених гљива, тј. утичу на квантитативне карактеристике својих популација, али могу да мењају и учесталости појединих генотипова, тј. утичу на квалитативни састав популација. Међу најважнијим показатељима популација које се мењају под утицајем фунгицида су: промене отпорности на фунгициде, промене агресивности и вируленције и промене у репродуктивним системима.
Утицај фунгицида на отпорност и агресивност популација
Степен таквог утицаја је одређен, пре свега, врстом коришћеног фунгицида, који се може поделити на вишестрани, олиго-сите и моно-сите.
Први укључују већину контактних фунгицида. Отпорност на њих (ако је то уопште могуће) контролише велики број веома слабо изражених гена. Ова својства одређују одсуство видљивих промена у отпорности популације након третирања фунгицидима (иако се у неким експериментима добија благо повећање отпорности). Популација гљивица очувана након прскања контактним фунгицидима састоји се од две групе сојева:
1) Сојеви сачувани у подручјима биљака које нису третиране леком. Пошто није било контакта са фунгицидом, агресивност и отпорност ових сојева се не мења.
2) Сојеви који су дошли у контакт са фунгицидом чија је концентрација на местима додира била испод леталне. Као што је већ поменуто, отпорност овог дела популације се такође не мења, међутим, због делимичног штетног дејства фунгицида, чак иу сублеталним концентрацијама, на метаболизам гљивичне ћелије, укупну кондицију и њену паразитску компоненту - агресивност - смањење (Деревиагина, Диаков, 1990).
Дакле, чак и неумрли део популације изложен контакту са фунгицидом има слабу агресивност и не може бити извор епифитотије. Стога је пажљив третман, којим се смањује учесталост удела популације која није у контакту са фунгицидом, услов за успех заштитних мера. Отпорност на олигозитне фунгициде контролише неколико адитивних гена.
Мутација сваког гена доводи до благог повећања резистенције, а укупан степен резистенције се одређује додавањем таквих мутација. Због тога се повећање отпора јавља у фазама. Пример постепеног повећања отпорности су мутације отпорности на фунгицид диметоморф, који се широко користи за заштиту кромпира од касне пламењаче. Отпорност на диметоморф је полигена и адитивна. Мутација у једном кораку мало повећава отпор.
Свака следећа мутација смањује величину мете и, последично, учесталост наредних мутација (Багирова ет ал., 2001). Повећање просечне резистенције популације после поновљених третмана олигозитним фунгицидом се дешава постепено и постепено. Брзину овог процеса одређују најмање три фактора: учесталост мутација гена отпорности, коефицијент резистенције (однос смртоносне дозе резистентног соја у односу на осетљиву) и ефекат мутација гена отпорности на фитнесс.
Учесталост појаве сваке наредне мутације је мања од претходне, па је процес ослабљен (Багирова и сар., 2001). Међутим, ако се у популацији јављају процеси рекомбинације (сексуални или парасексуални), онда је могуће комбиновати различите мутације родитеља у хибридном соју и убрзати процес. Дакле, панмикс популације брже стичу отпорност од агамичних, а код ових других, популације које немају баријере вегетативне некомпатибилности, брже од популација подељених таквим баријерама. С тим у вези, присуство у популацијама сојева који се разликују по типовима парења убрзава процес стицања отпорности на олигозитне фунгициде.
Други и трећи фактор не доприносе брзој акумулацији сојева отпорних на диметоморф у популацијама. Свака следећа мутација приближно удвостручује отпорност, која је незнатна, а истовремено смањује и брзину раста у вештачкој средини и агресивност (Багирова и сар., 2001; Стем и Кирк, 2004). Због тога међу природним сојевима П. инфестанс, чак и сакупљеним из засада кромпира третираних диметоморфом, практично нема отпорних.
Популацију третирану олигозитним фунгицидом такође ће чинити две групе сојева: они који нису били у контакту са фунгицидом и због тога нису променили почетне карактеристике (ако се у овој групи нађу отпорни сојеви, неће се акумулирати због већа агресивност и компетитивност осетљивих сојева) и сојеви изложени сублеталним концентрацијама фунгицида. Међу овим последњима је могуће накупљање отпорних сојева, јер овде имају предности у односу на осетљиве.
Дакле, при употреби олигозитних фунгицида није толико важан пажљив третман колико висока концентрација лека, неколико пута већа од смртоносне дозе, јер је степенастом мутагенезом почетна резистенција мутираних сојева ниска.
Коначно, мутације отпорности на моносите фунгициде су веома експресивне, што значи да једна мутација може дати висок ниво отпорности до потпуног губитка осетљивости. Због тога се пораст отпорности становништва дешава веома брзо.
Примери таквих фунгицида су фениламиди, укључујући најчешћи фунгицид металаксил. Мутације отпорности на њега јављају се са великом фреквенцијом, а степен отпорности код мутаната је веома висок - превазилази осетљиви сој хиљаду или више пута (Деревиагина ет ал., 1993). Иако се стопа раста и агресивност резистентних мутаната смањује на позадини смрти осетљивих сојева од системског фунгицида, број резистентне популације нагло расте, а истовремено расте и њена агресивност. Дакле, после неколико година употребе фунгицида, агресивност резистентних сојева не само да се може изједначити са агресивношћу осетљивих сојева, већ је чак и премашити (Деревиагина, Диаков, 1992).
Утицај на сексуалну рекомбинацију
Пошто се честа појава типа парења А2 у популацијама П. инфестанс поклопила са интензивном употребом металаксила против касне пламењаче, предложено је да металаксил изазива конверзију типова парења. Код врсте П. параситица таква конверзија под утицајем хлоронеба и металаксила је експериментално доказана (Ко, 1994). Један пролаз на медијуму са ниском концентрацијом металаксила довео је до појаве хомоталних изолата из соја П. инфестанс осетљивог на метал П. инфестанс са типом парења А1 (Савенкова, Цхерепникова-Аникина, 2002). Током наредних пасажа на подлози са већом концентрацијом металаксила, није било могуће детектовати нити један изолат са типом парења А2, међутим, већина изолата, укрштањем са А2 изолатима, уместо ооспора, формирала је ружне гроздове мицелијума и била је стерилна. . Проласци резистентног соја са типом парења А2 на подлози са високом концентрацијом металаксила омогућили су откривање три облика промена у типу парења: 1) потпуна стерилност при укрштању са изолатима А1 и А2; 2) хомотализам (формирање ооспора у монокултури); 3) конверзија типа парења А2 у А1. Дакле, металаксил може бити узрок промене типова парења у популацијама П. инфестанс и, последично, појаве сексуалне рекомбинације у њима.
Утицај на вегетативну рекомбинацију
Неки гени отпорности на антибиотике повећали су учесталост хетерокариотизације хифа и диплоидизације језгара (Поединок и Диаков, 1981). Као што је раније наведено, хетерокариотизација хифа током фузије различитих сојева П. инфестанс се јавља веома ретко због феномена вегетативне инкомпатибилности код ове гљиве. Међутим, гени отпорности на неке антибиотике могу имати нежељене ефекте који резултирају превазилажењем вегетативне некомпатибилности. Ген отпорности на стрептомицин мутанта 1С-1 имао је ово својство. Присуство таквих мутаната у пољским популацијама Пхитопхтхора може повећати проток гена између сојева и убрзати адаптацију целе популације на нове сорте или фунгициде.
Неки фунгициди и антибиотици могу утицати на учесталост митотичке рекомбинације, што такође може променити учесталост генотипова у популацијама. Широко коришћени фунгицид беномил везује се за бета-тубулин, протеин од којег су изграђене микротубуле цитоскелета и на тај начин ремети процесе сегрегације хромозома у анафази митозе, повећавајући учесталост митотичке рекомбинације (Хастие, 1970).
Фунгицид пара-флуорофенилаланин, који се користи за лечење брестова од холандске болести, има исто својство. Пара-флуорофенилаланин је такође повећао учесталост рекомбинације код хетерозиготних диплоида П. инфестанс (Поединок ет ал., 1982).
Цикличне промене генотипског састава популација у животном циклусу П. инфестанс
Класични развојни циклус П. инфестанс у умереном појасу састоји се од 4 фазе.
1) Фаза експоненцијалног раста популације (полициклична фаза) са кратким генерацијама. Ова фаза обично почиње у јулу и траје 1,5-2 месеца.
2) Фаза у којој престаје раст популације услед наглог смањења удела незахваћеног ткива или појаве неповољних временских услова. На фармама које врше рано уклањање врхова пре жетве, ова фаза је ван годишњег циклуса.
3) Фаза презимљавања у кртолама, праћена значајним смањењем величине популације услед случајне инфекције кртола, спорог развоја заразе у њима, одсуства поновне инфекције кртола у нормалним условима складиштења, труљења и одбацивања заражених кртола. .
4) Фаза спорог развоја у земљишту и на садницама (моноциклична фаза), у којој трајање генерације може да достигне месец или више (крај маја - почетак јула). Обично је у овом тренутку болесно лишће тешко открити чак и уз посебна запажања.
Фаза експоненцијалног раста популације (полициклична фаза)
Бројна запажања (Пшедетскаиа, Козубова, 1969; Борисенок, 1969; Осха, 1969; Диаков, Супрун, 1984; Рибакова, Диаков, 1990) показала су да се на почетку епифитотије слабо вирулентни и слабо агресивни клонови који касније замењују предњачи. вирулентнијим и агресивнијим. Штавише, стопа раста популацијске агресивности је већа што је сорта биљке домаћина мање отпорна.
Како популација расте, расте концентрација и селективно важних гена уведених у комерцијалне сорте (Р1-Р4) и селективно неутралних (Р5-Р11). Тако је у популацијама у близини Москве 1993. просечна вируленција од краја јула до средине августа порасла са 8,2 на 9,4, при чему је највећи пораст забележен за селективно неутрални ген вируленције Р5 (са 31 на 86% вирулентних клонова) ( Смирнов, 1996).
Смањење стопе раста становништва праћено је смањењем паразитске активности становништва. Стога су у депресивним годинама и укупан број раса и удео високо вирулентних раса нижи него у епифитотским годинама (Борисенок, 1969). Ако се на врхунцу епифитоте временске прилике промене у неповољне за касну пламењачу и смање инфестацију кромпира, онда се смањује и концентрација високо вирулентних и агресивних клонова (Рибакова и сар., 1987).
Повећање фреквенције гена који утичу на вируленцију и агресивност популације може бити последица селекције вирулентнијих и агресивнијих клонова у мешовитој популацији. Да би се демонстрирала селекција, развијена је метода за анализу неутралних мутација која се успешно користи у хемостатским популацијама квасца (Адамс ет ал., 1985) и Фусариум граминеарум (Виебе ет ал., 1995).
Учесталост мутаната отпорних на бластицидин С у пољској популацији П. инфестанс опадала је паралелно са порастом агресивности популације, што указује на промену доминантних клонова у процесу раста популације (Рибакова и сар., 1987). .
Фаза зимовања у кртолама
Током зимовања у кртолама кромпира вирулентност и агресивност сојева П. инфестанс се смањује, а смањење вируленције се дешава спорије него код агресивности (Рибакова, Диаков, 1990). Очигледно, у условима који подстичу брзи раст популације (р-селекција), гени „екстра” вируленције и висока агресивност показују се корисним, па је развој епифитотије праћен селекцијом најагресивнијих и најагресивнијих клонова. У условима засићености животне средине, када не игра главну улогу брзина репродукције, већ постојаност постојања у неповољним условима (К-селекција), гени „екстра“ вируленције и агресивност смањују кондицију, а клонови имају ове гени први изумиру, тако да се просечна агресивност и вируленција популације смањује.
Вегетативна фаза у земљишту
Ова фаза је најмистериознија у животном циклусу (Андривон, 1995). Његово постојање се постулира чисто спекулативно - због недостатка информација о томе шта се дешава са патогеном током дужег временског периода (понекад више од месец дана) - од појаве садница кромпира до појаве првих пега болести на њих. На основу запажања и експеримената, реконструисано је понашање гљиве у овом периоду живота (Хирст, Стедман, 1960; Богуславскаиа, Филиппов, 1976).
На зараженим кртолама у земљишту може се формирати спорулација гљиве. Добијене споре клијају хифама, које могу дуго да вегетирају у земљишту. Примарне (формиране на кртолама) и секундарне (на мицелијуму у земљишту) споре се капиларним струјама дижу на површину земљишта, али стичу способност да заразе кромпир тек након што се доњи листови спусте и дођу у додир са површином земљишта. Такви листови (наиме, на њима се налазе прве пеге болести) се не формирају одмах, већ након дуготрајног раста и развоја врхова кромпира.
Дакле, сапротрофна вегетациона фаза може постојати иу животном циклусу П. инфестанс. Ако је у паразитској фази животног циклуса агресивност најважнија компонента фитнеса, онда је у сапротрофној фази селекција усмерена на смањење паразитских својстава, као што је експериментално показано за неке фитопатогене гљиве (видети Царсон, 1993). Стога, у овој фази циклуса, агресивна својства треба најинтензивније изгубити. Али до сада нису спроведени никакви директни експерименти који би потврдили изнете претпоставке.
Сезонске промене утичу не само на патогена својства П. инфестанс, већ и на отпорност на фунгициде, која се повећава у полицикличној фази (у време епифитотија) и смањује током зимског складиштења (Деревиагина ет ал., 1991; Кадисх, Цохен, 1992). Посебно интензиван пад отпорности на металаксил примећен је у периоду између садње оболелих кртола и појаве првих пега болести на пољу.
Интраспецифична специјализација и њена еволуција
П. инфестанс изазива епидемије код два комерцијално важна усева, кромпира и парадајза. Епифитотије на кромпиру су почеле убрзо након што је гљива ушла у нова подручја. Пораз парадајза је такође забележен убрзо након што се зараза појавила на кромпиру, али су епифитоте на парадајзу забележене тек стотину година касније - средином двадесетог века. Овако пишу о поразу парадајза у САД од Галеглија и Нидерхаузера
(1962): „Око 100 година након тешке епифитоте 1845. године, било је мало или нимало покушаја да се развију отпорне сорте парадајза. Иако је касна пламењача први пут забележена на парадајзу далеке 1848. године, она није постала предмет озбиљне пажње одгајивача ове биљке све до озбиљног избијања болести 1946. године. У Русији је касна мрља парадајза регистрована још у 60. веку. „Истраживачи дуго времена нису обраћали пажњу на ову болест, јер није изазвала значајну економску штету. Али 70-1979-их година. У XNUMX. веку епифитотије касне пламењаче на парадајзу примећене су и у Совјетском Савезу, углавном у Доњем Поволжју, Украјини, Северном Кавказу и Молдавији...“ (Балашова, XNUMX).
Од тада, пламењача парадајза је постала годишња појава, која се шири по читавом индустријском и кућном узгоју и наноси огромну економску штету овој култури. Шта се десило? Зашто је до прве појаве паразита на кромпиру и епифитотског оштећења ове културе дошло скоро истовремено, док је на парадајзу требало да прође век до епифитотског оштећења? Ове разлике фаворизују мексички, а не јужноамерички извор инфекције. Ако је врста Пхитопхтхора инфестанс настала као паразит мексичких гомољастих врста из рода Соланум, онда је јасно зашто је култивисани кромпир, који припада истом делу рода као и мексичка врста, био тако тешко погођен, али због недостатка коеволуције са паразитом, нису развили механизме специфичне и неспецифичне резистенције.
Парадајз припада другом делу рода, тип његовог метаболизма се значајно разликује од гомољастих врста, па је, упркос чињеници да парадајз није ван прехрамбене специјализације П. инфестанс, интензитет његовог оштећења био недовољан да проузроковати озбиљне економске губитке.
Појава епифитозија на парадајзу је последица озбиљних генетских промена паразита, које повећавају његову способност (патогеност) током паразитирања. Верујемо да је нова форма, специјализована за паразитирање на парадајзу, раса Т1 коју описује М. Галлегли, која инфицира сорте чери парадајза (Ред Цхерри, Оттава), отпорне на Т0 расу уобичајену на кромпиру (Галлегли, 1952). Очигледно, мутација (или серија мутација) која је претворила Т0 расу у Т1 расу довела је до појаве клонова високо прилагођених оштећењу парадајза. Као што се често дешава, повећање патогености за једног домаћина било је праћено смањењем на другог, односно настала је почетна, још непотпуна, интраспецифична специјализација - за кромпир (раса Т0) и парадајз (раса Т1).
Који докази подржавају ову претпоставку?
- Појава на кромпиру и парадајзу. На листовима парадајза преовлађује раса Т1, док је на листовима кромпира ретка. Према речима С.Ф.Багирова и Т.А. Орешонкова (није објављено) у Московској области 1991-1992, појава расе Т1 у засадима кромпира била је 0%, ау засадима парадајза – 100%; у 1993-1995 – 33% и 90%, респективно; у 2001. години – 0% и 67%. Слични подаци добијени су у Израелу (Цохен, 2002). Експерименти са инфекцијом кртола кромпира изолатима расе Т1 и мешавином изолата Т0 и Т1 показали су да су изолати расе Т1 слабо очувани у кртолама и да су замењени изолатима расе Т0 (Диаков ет ал., 1975; Рибакова, 1988) .
2) Динамика расе Т1 у засадима парадајза. Примарну инфекцију листова парадајза спроводе изолати Т0 расе, који доминирају у анализи заразе у првим пегама формираним на листовима. Ово потврђује општеприхваћени образац миграције паразита: Главна инфекција са кромпира је раса Т0, међутим, мали број клонова расе Т1 сачуваних у кромпиру, једном на парадајзу, истискује расу Т0 и акумулира се пред крај епифитотија. Такође је могуће да постоји алтернативни извор инфекције листова парадајза са Т1 расом, не тако моћан као кртоле и листови кромпира, али константан. Дакле, овај извор има мало утицаја на генетску структуру популације која инфицира парадајз, али накнадно одређује акумулацију Т1 расе (Рибакова, 1988; Диаков ет ал., 1994).
3) Агресивност према кромпиру и парадајзу. Вештачка инфекција листова парадајза и кромпира изолатима раса Т0 и Т1 показала је да су прве агресивније за кромпир него за парадајз, а друге за парадајз него за кромпир. Ове разлике се манифестују у измештању изолата различите расе из мешовите популације током пасажа по листовима у стакленику (Диаков ет ал., 1975) и на пољским парцелама (Лебертон ет ал., 1999); разлике у минималном инфективном оптерећењу, периоду латенције, величини инфективних пега и производњи спора (Рибакова, 1988; Диаков ет ал., 1994; Легард ет ал., 1995; Форбес ет ал., 1997; Оиарзун ет ал., 1998; Лебертон ет ал., 1999; Вега-Санцхез и др., 2000;
Агресивност изолата Т1 расе на сорте парадајза које немају гене отпорности је толико висока да ови изолати спорулишу на листовима као на хранљивој подлози без некротизације зараженог ткива (Диаков ет ал., 1975; Вега-Санцхез ет ал., 2000. ).
4) Вируленција за кромпир и парадајз. Раса Т1 инфицира сорте чери парадајза које имају ген отпорности Пх1, док раса Т0 није способна да зарази ове сорте, тј. има ужу вируленцију. У односу на диференцијаторе
Потато Р гени показују инверзну везу, тј. сојеви изоловани из листова парадајза су мање вирулентни од сојева „кромпира” (Табела 11).
5) Неутрални маркери. О вишесмерној интраспецифичној селекцији сведочи и анализа неутралних маркера у популацијама П. инфестанс који паразитирају на кромпиру и парадајзу. У бразилским популацијама П. инфестанс, изолати из листова парадајза припадали су клонској линији УС-1, а из листова кромпира БР-1 линији (Суассуна ет ал., 2004). На Флориди (САД), од 1994. године, клон УС-90 је почео да доминира на кромпиру (више од 8% појављивања), а на парадајзу су клонови УС-11 и УС-17, а изолати последњег, агресивнији за парадајз. него за кромпир (Веингартнер, Томболато, 2004). Утврђене су значајне разлике у учесталости генотипова (ДНК отисака прстију) између изолата кромпира и парадајза за 1200 сојева П. инфестанс прикупљених у САД од 1989. до 1995. (Деахл ет ал., 1995).
Коришћење АФЛП методе омогућило је издвајање 74 соја сакупљених са листова кромпира и парадајза 1996-1997. у Француској и Швајцарској, у 7 група. Сојеви кромпира и парадајза нису се јасно разликовали, али се показало да су сојеви "кромпир" генетски разноврснији од сојева "парадајза". Први су пронађени у свих седам кластера, а други - само у четири, што указује на специјализованији геном потоњег (Кнапова и Гиси, 2002).
6) Механизми изолације. Ако популације паразита на две биљне врсте домаћина еволуирају у правцу сужавања специјализације ка „њиховом” домаћину, тада се јављају различити пре- и постмејотички механизми који спречавају међупопулацијску генетичку размену (Диаков и Лекомтсева, 1984).
Неколико студија је испитивало утицај извора родитељских сојева на ефикасност хибридизације. Приликом укрштања сојева изолованих из различитих врста рода Соланум у Еквадору (Олива ет ал., 2002), установљено је да се сојеви са типом парења А2 из дивље Соланацеае (клонска линија ЕЦ-2) најслабије укрштају са сојевима парадајза ( линија ЕЦ -3), а најефикасније се укрштају са сојем кромпира (ЕЦ-1).
Показало се да су сви хибриди непатогени. Аутори сматрају да је низак проценат хибридизације и смањење патогености код хибрида последица постмејотских механизама репродуктивне изолације популација.
У огледима Багирова и сар. (1998) укрштан је велики број сојева кромпира и парадајза са својствима раса Т0 и Т1. Најплоднији су били укрштања сојева Т1кТ1 изолованих из парадајза (36 ооспора у видном пољу микроскопа, 44% клијавости ооспора), најмање ефикасни укрштања Т0кТ1 раса изолованих од различитих домаћина (мали број формираних и клијавих ооспоре, висок удео абортивних и неразвијених ооспора). Показало се да је ефикасност укрштања изолата Т0 расе изолованих из кромпира средња. Пошто главни низ сојева Т0 расе инфицира кромпир, он има поуздан извор презимљавања – кртоле кромпира, услед чега је значај ооспора као презимљавајућих заразних јединица за популације кромпира низак. Прилагођена „форма парадајза” може да презими на парадајзу у облику ооспора (види доле) и стога одржава већу продуктивност полног процеса. Због високе плодности, Т1 стиче независан потенцијал за примарну инфекцију на парадајзу. На исти начин могу се тумачити и резултати које су добили Кнапова и сар. Укрштање сојева изолованих из кромпира са сојевима из парадајза дало је највећи број ооспора - 2002 по мм13,8. окружење (са опсегом од 5-19) и средњи проценат клијања ооспора (6,3 са опсегом од 0-24). Укрштање сојева изолованих из парадајза дало је најмањи проценат ооспора (7,6 са распоном 4-12) са највећим процентом клијања (10,8). Укрштања сојева изолованих из кромпира дала су средњи број ооспора (8,6 са високим опсегом података - 0-30) и најмањи проценат клијавости ооспора (2,7). Дакле, сојеви кромпира су мање плодни од сојева парадајза, али међупопулацијско укрштање није дало лошије резултате од интрапопулацијског укрштања. Можда разлике са горњим подацима Багирова и сар. објашњавају се чињеницом да су руски истраживачи радили са сојевима изолованим почетком 90-их година двадесетог века, а швајцарски истраживачи са сојевима изолованим крајем 90-их.
Ниска плодност може бити заснована на хетероплоидним сојевима. Ако је у мексичким популацијама, где су полни процес и примарна инфекција ооспоричним потомцима редован, већина проучаваних сојева П. инфестанс диплоидна, онда се у земљама Старог света уочава интрапопулацијски полиморфизам плоидности (ди-, три- и тетраплоидни сојеви, као и хетерокариотски сојеви са хетероплоидним језгрима) и сојеви који имају различите типове парења, тј. међусобно плодни, разликују се по нуклеарној плоидности (Тхерриен ет ал., 1989, 1990; Вхиттакер ет ал., 1992; Ритцх и Даггетт, 1995). Хетероплоидија језгара у антеридији и оогонији може бити узрок ниске плодности.
Што се тиче нуклеарне размене између хифа током анастомоза, то је спречено вегетативном некомпатибилношћу, која дели асексуалне популације на многе генетски изоловане клонове (Поединок и Диаков, 1987; Горбунова ет ал., 1989; Аникина ет ал., 1997б).
7) Конвергенција популација. Наведени подаци указују да је могућа хибридизација између „кромпир” и „парадајз” сојева П. инфестанс. Могућа је и реципрочна поновна инфекција различитих домаћина, али са смањеном агресивношћу.
Студија популацијских маркера у изолатима са суседних поља кромпира и парадајза 1993. године показала је да је приближно четвртина изолата изолованих из листова парадајза пренета са суседног поља кромпира (Долгова ет ал., 1997). Теоретски, могло би се претпоставити да би се дивергенција популација на два домаћина повећала и довела до појаве интраспецифичних специјализованих облика (ф.сп. кромпир и ф.сп. парадајз), поготово што се ооспоре могу сачувати у биљним остацима (Дрентх). и др., 1995. Багирова, Дјаков, 1998.) и семена парадајза (Рубин ет ал., 2001). Сходно томе, парадајз тренутно има извор пролећног обнављања независно од кртола кромпира.
Међутим, све се догодило другачије. Презимљавање са ооспорама омогућило је паразиту да избегне најужу фазу у свом животном циклусу - моноцикличну фазу вегетације у земљишту, током које се паразитска својства смањују, постепено се опорављајући лети у полицикличној фази.
Табела 11. Учесталости гена вируленције за сорте диференцијатора кромпира код сојева П. инфестанс
Земља | Година | Просечан број гена вируленције у сојевима | Аутор | |
од кромпира | од парадајза | |||
Француска | 1995 | 4.4 | 3.3 | Лебертон ет ал., 1999 |
1996 | 4.8 | 3.6 | Лебертон, Андривон, 1998 | |
Француска, Швајцарска | 1996-97 | 6.8 | 2.9 | Кнапова, Гиси, 2002 |
САД | 1989-94 | 5 | 4.8 | Гоодвин ет ал., 1995 |
САД, западни Вашингтон | 1996 | 4.6 | 5 | Дорранце ет ал., КСНУМКС |
1997 | 6.3 | 3.5 | " | |
Еквадор | 1993-95 | 7.1 | 1.3 | Оиарзун ет ал., 1998 |
Израел | 1998 | 7 | 4.8 | Цохен, КСНУМКС |
1999 | 6 | 5.7 | " | |
2000 | 6.7 | 6.1 | " | |
Русија, Москва регион | 1993 | 8.9 | 6.7 | Смирнов, 1996 |
Русија, различити региони | 1995 | 9.4 | 8 | Козловскаиа ет ал. |
1997 | 9.2 | 9.2 | " | |
2000 | 8.7 | 4.8 | " |
Примарне зооспорангије и зооспоре са којима ооспоре клијају имају висок степен паразитске активности, посебно ако су ооспоре настале партеногенетски под утицајем феромона од соја са супротним типом парења. Дакле, инфективни материјал на садницама парадајза из семена заражених ооспорама је високо патоген и за парадајз и за кромпир.
Ове промене су довеле до још једног реструктурирања становништва, израженог у следећим променама које су биле важне са епидемиолошке тачке гледишта:
- Заражене саднице парадајза постале су важан извор примарне инфекције кромпира (Филиппов, Иваниук, лична комуникација).
- Епифитотије на кромпиру су почеле да се примећују већ у јуну, око месец дана раније него иначе.
- У засадима кромпира повећан је проценат расе Т1, која се раније ту налазила у малим количинама (Уланова и сар., 2003).
- Сојеви изоловани из листова парадајза више се нису разликовали од сојева кромпира по вируленцији на диференцијаторима гена вируленције кромпира и почели су да надмашују "кромпирове" сојеве по агресивности не само на парадајзу, већ и на кромпиру (Лаврова и сар., 2003; Уланова и сар. , 2003).
Тако је уместо дивергенције дошло до конвергенције популације, са појавом једне популације на две биљке домаћина са високом вирулентношћу и агресивношћу према обе врсте.
Закључак
Дакле, упркос више од 150 година интензивног проучавања П. инфестанс, много тога остаје непознато у биологији, укључујући и популациону биологију овог узрочника најважнијих болести гајених биљака велебиља. Није јасно како пролазак појединих фаза животног циклуса утиче на структуру популација, који су генетски механизми каналисане варијабилности агресивности и вируленције, какав је однос између полног и клонског репродуктивног система у природним популацијама, како вегетативна некомпатибилност. је наследна, каква је улога кромпира и парадајза у примарној зарази ових усева и какав је њихов утицај на структуру популација паразита. Питања која су значајна за практичне активности, као што су генетски механизми промене агресивности паразита или ерозије неспецифичне резистенције кромпира, још нису решена. Како се истраживање кромпирове каше продубљује и шири, паразит поставља нове изазове за истраживаче. Међутим, унапређење експерименталних могућности и појава нових методолошких приступа манипулисању генима и протеинима омогућавају нам да се надамо успешном решењу постављених питања.
Чланак је објављен у часопису „Заштита кромпира“ (бр. 3, 2017.)